龔 強 丁 利 肖家勇 羅斯斯 焦艷娜

GONG Qiang 1 DING Li 1 XIAO Jia－yong 1 LUO Si－si 2 JIAO Yan－na 1

朱紹華1 文江為1 付善良1 王利兵1

ZHU Shao－h(huán)ua 1 WEN Jiang－wei 1 FU Shan－liang 1 WANG Li－bing 1

（1.湖南出入境檢驗檢疫局技術中心食品安全科學技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

（1.Technology Center of Hunan Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hunan Key Laboratory of Food Safety Science and Technology，Changsha，Hunan 410004，China；2.Shanghai Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135，China）

合成色素即人工合成色素，用于食品中增加色澤的非營養(yǎng)成分，主要以化工產(chǎn)品為原料經(jīng)有機反應合成。這類色素大多具有一定毒性，包括毒性、致泄性、致癌性，其中偶氮化合物合成著色劑的致癌作用最為明顯［1，2］，中國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》明確規(guī)定了合成色素的使用品種和使用量，其他國家也均嚴格控制其應用范圍和使用量［3，4］。飲料中添加合成色素的現(xiàn)象較為常見，超范圍、超劑量使用情況也時有報道，對人們的健康安全存在很大隱患。因此檢測飲料中合成色素的含量具有重要意義。

目前，國家標準、文獻［5，6］報道中合成色素的檢測主要為高效液相色譜法，偶有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法報道［2］，方法前處理較為繁瑣。1992年Sano等［7］將免疫反應中抗原抗體反應的高度特異性與PCR技術中的高靈敏度、高擴增效能結合起來，開發(fā)了免疫－PCR技術（immuno polymerase chain reaction，IPCR）。已有報道［8－12］表明該方法在致病微生物檢測、腫瘤標記物追蹤、細胞因子分析以及毒素定量等生物技術領域獲得了較好的研究效果，但該方法應用于食品科學中小分子物質(zhì)的檢測還鮮有報道［13］。赤蘚紅是合成色素中的一種，常用于飲料。本試驗以赤蘚紅作為研究對象，采用免疫PCR方法，建立飲料中赤蘚紅的間接競爭免疫PCR檢測方法，檢測低限為10.0 fg／g，適用于不同飲料中赤蘚紅及其他合成色素的痕量、快速檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑

4 －（N－馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷－1－羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（Sulfo－SMCC）、戊二醛、牛血清白蛋白（BSA）、吐溫－20：美國Sigma－Aldrich公司；

NaCl、EDTA：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

赤蘚紅標準品：中國計量科學研究院；

赤蘚紅多克隆抗體：江南大學食品安全科學研究所；

超濾管：截留分子量10，30 K，美國Millipore公司；

SYBR?Premix EX Taq TM Ⅱ熒光PCR試劑盒：日本Takara公司；

其他試劑：除另有規(guī)定外，均為分析純試劑；

試驗用水：超純水。

1.1.2 DNA分子（Takara合成）

上游引物：5’－GGGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT－3’；

下游引物：5’－GCCGAAAAATCTGGAAGGTC－3’；

5 ’端 巰 基 修 飾 探 針 （89 bp ssDNA）：5’－SH－GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CATTAGTCCT AGACAACGTT ACTATAACGT GAATGTAATG AACCTACAAG ACCTTCCAGA TTTTTCGGC－3’。

1.2 儀器

熒光定量PCR儀：PRISM 7000型，美國生物公司；

振蕩器：SA300 Shaker型，日本Yamato公司；

微孔板振蕩器：THERMO Star型，美國 Bmg Labtech公司；

離心機：Beckman Coulter型，德國貝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA－赤蘚紅抗體偶聯(lián)物的制備 2.5 mg雙異功能團偶聯(lián)劑Sulfo－SMCC溶解于1 m L超純水，取10μL溶于980μL PBS緩沖液（含 150 m M NaCl）中，加入 20μL 80μg／m L赤蘚紅抗體溶液，室溫振蕩反應30 min，用截留分子量為10 K的超濾管對反應混合物物進行超濾（水平轉子，5 000 r／min離心50 min），除去多余的偶聯(lián)劑。截留物用990μL PBS緩沖液（含5 m M EDTA）復溶，加入10μL 1.0μM ssDNA，室溫振蕩反應30 min，反應混合物用截留分子量30 K的超濾管進行超濾，除去未結合的DNA。截留物再用1 m L PBS（含5 m M EDTA）溶解，溶解產(chǎn)物即為DNA－赤蘚紅抗體偶聯(lián)物。

1.3.2 抗原包被PCR管 熒光定量PCR管用50μL 0.8%的戊二醛溶液37℃包被5 h，超純水振蕩洗滌PCR管3次，每次5 min；50μL 0.3μg／m L的赤蘚紅抗原包被PCR管，37℃包被2 h，100μL p H 7.2 PBST（含0.05%Tween－20 PBS）緩沖液振蕩洗滌3次，每次3 min，再用100μL p H 7.2封閉液（含1%BSA的PBS緩沖液）37℃封閉2 h，上述PBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次3 min。

1.3.3 免疫傳感器的構建 取上述包被好PCR管，加入25μL 10倍梯度稀釋濃度系列的赤蘚紅標準品（濃度從0.05～50.0 pg／m L），每管中分別再加入25μL DNA－赤蘚紅抗體偶聯(lián)物，標準品中的赤蘚紅與PCR管壁上包被的抗原競爭結合抗體，37℃反應30 min，用PBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次3 min，最后將PCR管在吸水紙上拍打干凈。加入SYBR?Premix EX Taq TM Ⅱ2×Buffer 10μL，上游引物、下游引物各0.8μL，ROX Reference Dye 0.4μL，滅菌蒸餾水補足到20μL。熒光定量PCR儀測定。擴增條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，40個循環(huán)。獲得偶聯(lián)DNA的擴增曲線、熔解曲線。

1.3.4 樣品檢測 選取市售飲料作為檢測研究對象，樣品用超純水稀釋1 000倍，過0.22μm濾膜后直接進行競爭性免疫PCR檢測，根據(jù)標準品Ct曲線計算濃度值。

2 結果與分析

2.1 熒光PCR檢測

熒光定量PCR采用SYBR?GreenⅠ嵌合熒光染料，從溶解曲線上可見78℃處有單一峰，無非特異性擴增及引物二聚體（見圖1）。試驗中的SYBR?Premix EX Taq TM Ⅱ熒光PCR試劑采用SYBR?GreenⅠ嵌合熒光染料，能夠在較寬的范圍內(nèi)進行準確地定量，具有抑制非特異性反應、再現(xiàn)性好的特性。

圖1 熒光PCR溶解曲線Figure 1 Dissociation curve of fluorescence PCR

2.2 驗包被原、DNA－抗體偶聯(lián)物濃度的優(yōu)化

包被原和DNA－抗體偶聯(lián)物的濃度比例按照ELISA棋盤法進行優(yōu)化，包被原的濃度參照普通ELISA的包被濃度，從1.0μg／m L 10倍梯度稀釋至0.01 ng／m L，抗體－DNA偶聯(lián)物（抗體 40.0 ng／m L、DNA 40 n M）2倍梯度稀釋至1.0 ng／m L（以抗體濃度計），加入同樣濃度的赤蘚紅進行熒光PCR反應，根據(jù)同一條件下加入目標物和未加目標物循環(huán)數(shù)的差值，選取最合適的濃度配比。擴增效率越高，循環(huán)數(shù)差值越大，最終確定包被原濃度0.2μg／m L，抗體濃度10.0 ng／m L，DNA濃度10 n M。

2.3 方法線性范圍與檢測低限

固定包被原濃度0.2μg／m L、抗體濃度10.0 ng／m L、DNA濃度10 n M，優(yōu)化競爭性赤蘚紅濃度：從5.0μg／m L 10倍梯度稀釋至5.0 fg／m L，試驗結果表明：Ct值隨著加入標準品赤蘚紅濃度的增加而增大（見圖2），當赤蘚紅濃度大于0.5 ng／m L時，Ct值與空白對照（不加赤蘚紅標準品）無明顯差異。以濃度為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標準曲線，在0.05～50.0 pg／m L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系（見圖3），線性方程為y＝0.336x＋11.69，相關系數(shù)為0.995 0，檢測底限為10.0 fg／m L。線性范圍為0.05～50.0 pg／m L，赤蘚紅濃度為0.05，0.5，5.0，50.0 pg／m L時對應的Ct值分別為12.03，12.39，12.66，13.06，相關系數(shù)為0.995 0。

圖2 競爭性赤蘚紅線性范圍免疫PCR擴增圖Figure 2 Linear Immuno－PCR amplification of competitive erythrosine

圖3 赤蘚紅免疫PCR檢測標準曲線圖Figure 3 Standard curve of erythrosine by Immuno－PCR

2.4 方法的回收率與精密度

采用市售空白飲料樣品進行加標回收試驗，選擇高、中、低（50.0，2.0，0.05 pg／m L）3個濃度，按照上述方法分別進行添加回收試驗，每個添加濃度平行測定6次，取平均值計算加標回收率和精密度。由表1可知，方法平均回收率為60%～120%，精密度＜20%，回收率高，重復性好。

表1 陰性樣品添加回收率和精密度Table 1 Recoveries and precisions of negative samples（n ＝6）

2.5 實際樣品的檢測

對市售10種飲料分別采用國家標準（液相色譜法）和本方法進行檢測，其中1份陽性樣品重復檢測6次（見表2），采用方差分析，P＜0.05，表明兩種方法檢測結果相比較無顯著差異。

表2 陽性樣品檢測結果Table 2 Results of positive sample／（mg·L－1）

3 結論

本試驗通過對免疫PCR方法條件的優(yōu)化、空白樣品的添加回收試驗以及實際樣品的檢測，建立了飲料中赤蘚紅的免疫PCR快速檢測方法，方法快速、簡便，與常規(guī)液相色譜法比較檢測結果無顯著差異。所建立的方法適合用于飲料中赤蘚紅的快速檢測。

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