王朗，盧燕云，周琴，水小蘭

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430060；2.武漢大學(xué)心血管病研究所，湖北武漢 430060；3.武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北武漢 430060）

·論著·

小鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立及評價(jià)

王朗1，2，盧燕云2，周琴3，水小蘭1

（1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430060；2.武漢大學(xué)心血管病研究所，湖北武漢 430060；3.武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北武漢 430060）

目的探討穩(wěn)定的小鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備和評價(jià)方法，評價(jià)缺血時(shí)間的延長對缺血再灌注損傷的影響。方法采用硅膠線栓暫時(shí)性阻塞小鼠大腦中動(dòng)脈制備腦缺血再灌注損傷模型，通過神經(jīng)功能評分、TTC染色、伊文氏藍(lán)染色、Tunel染色、免疫熒光染色等方法評價(jià)45 min和60 min缺血再灌注時(shí)間所導(dǎo)致的梗死體積、神經(jīng)功能、神經(jīng)元凋亡以及氧化應(yīng)激水平的差異。結(jié)果與45 min組相比，60 min缺血再灌注損傷使腦梗死體積增加了78.21%、神經(jīng)功能評分升高了31.66%，神經(jīng)元凋亡比例增加了44.49%，血腦屏障的破壞程度和氧化應(yīng)激水平隨著缺血時(shí)間的增加也明顯增高。結(jié)論通過嚴(yán)格的手術(shù)操作和嚴(yán)密的術(shù)中監(jiān)測，可以獲得穩(wěn)定的小鼠腦缺血再灌注損傷模型，缺血時(shí)間的延長顯著增加了腦組織的損傷。

腦缺血再灌注損傷；凋亡；氧化應(yīng)激；小鼠

腦卒中是多種腦血管疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)形式，具有極高的致殘率和較高的致死率，是危害人類生命健康的最主要疾病之一。近30年來我國腦卒中發(fā)病率逐年升高，以每年8.7%的速度上升，目前已達(dá)到185～219/10萬人，每年至少有200萬新發(fā)病例[1]。其中，缺血性腦卒中是腦卒中最常見的發(fā)病類型，在某些地區(qū)可以占到整個(gè)腦卒中病例的79%。通過組織纖溶酶原激活劑(tPA)溶栓治療恢復(fù)腦組織供血是目前臨床上治療缺血性腦卒中唯一有效的方法。但由于嚴(yán)格的治療時(shí)間窗限制，只有不到5%的卒中患者有機(jī)會(huì)接受tPA溶栓治療[2]。而在持續(xù)較長時(shí)間的腦缺血后，即使恢復(fù)了阻塞血管的血流灌注仍會(huì)導(dǎo)致腦組織不可逆的損傷，并且增加腦出血的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，闡明腦缺血以及再灌注過程中的病理生理機(jī)制，研究有效的卒中治療靶點(diǎn)對于臨床腦卒中的治療具有重要意義。

小鼠和基因工程小鼠資源是目前疾病機(jī)制研究、基因功能研究、藥物創(chuàng)制等領(lǐng)域最重要的動(dòng)物模型之一，也是這些領(lǐng)域創(chuàng)新研究的必要條件[4]。利用基因工程小鼠針對腦卒中病理過程中的各個(gè)分子環(huán)節(jié)進(jìn)行研究，對闡明腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制，尋找腦卒中治療的分子靶點(diǎn)具有重要的意義。而建立穩(wěn)定的小鼠腦缺血及再灌注損傷的動(dòng)物模型并建立系統(tǒng)的模型評價(jià)體系是利用基因工程小鼠研究腦卒中病理生理機(jī)制的前提及關(guān)鍵。本文將系統(tǒng)闡述小鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備及評價(jià)方法，對比45 min和60 min缺血再灌注時(shí)間所導(dǎo)致的損傷差異，并對缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的凋亡及氧化應(yīng)激損傷進(jìn)行評價(jià)。這些實(shí)驗(yàn)方法及所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將為我們后續(xù)以基因工程小鼠為研究對象的科學(xué)研究提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用雄性小鼠，11～12周齡，體重25～30 g，背景為C57BL/6的野生型小鼠(購自北京華阜康生物科技有限公司，質(zhì)量合格證號：949431)，所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)心血管病研究所SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SPF級小鼠飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫22℃～24℃，濕度40%～70%，明暗交替照明時(shí)間為12 h，自由飲水?dāng)z食。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組60只實(shí)驗(yàn)小鼠，通過大腦中動(dòng)脈缺血再灌注建立腦梗死模型(I/R)，隨機(jī)分為45 min缺血再灌注損傷組(30只)和60 min缺血再灌注損傷組(30只)。

1.3 小鼠腦缺血再灌注損傷模型通過暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈阻塞(Transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)手術(shù)制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型[5-6]。操作流程如下：(1)使用3%異氟烷麻醉小鼠，8%硫化鈉脫去頸部的鼠毛，顱頂鼠毛用手術(shù)剪迅速剪掉，3%活力碘消毒頸部及顱頂皮2次，75%酒精脫碘1次。(2)在小鼠的顱頂部位橫向切口，暴露顱骨，用鑷子輕輕剝離顱骨表面的結(jié)締組織。將激光多普勒血流儀(Periflux System 5010，Perimed)的光纖探頭用生物膠固定在前囟后方2 mm、左側(cè)5 mm的部位，即大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域。(3)將小鼠仰臥固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA、CCA，在ECA遠(yuǎn)心端結(jié)扎和剪一小口，將硅膠線栓(6～0，Doccol)由剪口送入ICA，當(dāng)線栓進(jìn)入深度在9～11 mm時(shí)遇阻力，此時(shí)可在多普勒血流儀器上觀察到血流的急劇下降，固定線栓。(4)從線栓進(jìn)入腦血管至血流下降遇阻力時(shí)開始計(jì)時(shí)，45 min或60 min后將線栓拔出，并將ECA近心端結(jié)扎，迅速松開CCA處動(dòng)脈夾。觀察血流恢復(fù)情況，血流下降大于基礎(chǔ)血流的75%以上，血流恢復(fù)達(dá)基礎(chǔ)血流的70%以上，視為缺血再灌注模型制備成功。(5)縫合小鼠頸部及頭部皮膚，并用活力碘消毒傷口。手術(shù)結(jié)束后，將小鼠放在28℃溫箱中，待小鼠蘇醒后轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)籠中常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 梗死體積的評價(jià)采用TTC染色法評價(jià)梗死體積[5]。抓取小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取出腦組織，將其放入1 mm小鼠腦模，置于-20℃冰箱冰凍后切成1 mm厚的切片，共切7片。將切片立即置于10 ml 2%TTC溶液中，37℃恒溫孵育10 min。正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色。用10%中性福爾馬林溶液固定腦組織切片后拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量并計(jì)算腦梗死體積。梗死體積%=(對側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)未梗死體積)/(對側(cè)大腦半球體積×2)×100%。

1.5 神經(jīng)功能的評價(jià)在tMCAO手術(shù)后的24 h對小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能及行為學(xué)評分，采用基于Berderson神經(jīng)功能評分改進(jìn)的9分制評分方法[7]。0分：無神經(jīng)受損的癥狀；1分：提尾時(shí)對側(cè)前肢蜷曲，或者不能完全到達(dá)患側(cè)前肢；2分：提尾時(shí)對側(cè)肩膀內(nèi)收；3分：平推，向?qū)?cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降；4分：可自發(fā)的向各個(gè)方向運(yùn)動(dòng)，但在脫尾巴時(shí)只向?qū)?cè)轉(zhuǎn)彎；5分：自發(fā)運(yùn)動(dòng)時(shí)轉(zhuǎn)圈或只向?qū)D(zhuǎn)；6分：無自主運(yùn)動(dòng)，只在刺激時(shí)運(yùn)動(dòng)；7分：無自主運(yùn)動(dòng)，刺激時(shí)也無運(yùn)動(dòng)；8分：與腦缺血有關(guān)的死亡。

1.6 血腦屏障破壞程度的評價(jià)通過伊文氏藍(lán)染色法評價(jià)血腦屏障的破壞情況[8]。用磷酸鹽緩沖液(PBS)配置2%的伊文氏藍(lán)染液，在缺血60 min后在灌注的即刻，按照4 ml/kg體重將伊文氏藍(lán)染液注入小鼠體循環(huán)。24 h后麻醉小鼠，用PBS灌流小鼠全身組織器官后完整取出腦組織，沿中線將梗死半球和非梗死半球分開，放入EP管中-80℃保存。進(jìn)行檢測時(shí)從-80℃冰箱中取出腦組織，迅速向腦組織里加入3顆預(yù)冷的鋼珠和1 ml冰50%(w/v)三氯乙酸溶液，蓋好EP管蓋，將EP管放入研磨儀研磨罐中，30次/s，碾磨1 90 s。于4℃下離心(1 000 g，5 min)后取200 μl上清液，用酶標(biāo)儀610 nm測吸光值。參照Evens Blue標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算腦組織中Evens Blue含量(μg/g大腦重量)。

1.7 神經(jīng)元凋亡的評價(jià)使用Tunel染色法評價(jià)神經(jīng)元的凋亡。取缺血再灌注損傷后24 h的腦組織制備8 μm厚的冰凍切片。將冰切組織切片置于(pH 7.4)1%的多聚甲醛中，室溫固定水解10 min；PBS洗兩次，每次5 min；然后根據(jù)Tuenl試劑盒的操作流程，依次加入平衡緩沖液，TdT酶反應(yīng)液，終止/洗滌緩沖液，抗地高辛抗體進(jìn)行孵育。最后碘化丙啶復(fù)染，封片干燥，-20℃避光保存；在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)凋亡神經(jīng)元細(xì)胞。

1.8 氧化應(yīng)激水平的評價(jià)8OHDG和4HNE是反映氧化應(yīng)激水平的兩個(gè)重要標(biāo)志[9]。8OHDG是DNA氧化損傷的標(biāo)志物，4NHE則是脂質(zhì)氧化損傷的標(biāo)志物。取缺血再灌注損傷后24 h的腦組織制備8 μm厚的冰凍切片。將冰切組織切片置于1%的多聚甲醛(pH 7.4)中，室溫固定15 min。用含10%羊血清的PBS漂洗切片后，在組織上滴加抗4HNE(ab48506，Abcam，Cambridge，MA)或8OHDG抗體(sc-66036，Santa cruz，CA)，4°C孵育過夜。PBS漂洗后加入相應(yīng)二抗37°C孵育1 h。PBS漂洗后DAPI復(fù)染細(xì)胞核，封片干燥，-20℃避光保存；在熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS11.0進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，多組間比較采用Oneway-ANOVA，兩組間比較用非配對Student's t-test分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積的評價(jià)45 min及60 min缺血再灌注均造成了明顯的腦梗死。手術(shù)24 h后取材評價(jià)梗死體積百分比，45 min組為(24.23±4.11)mm3， 60 min組為(43.18±3.20)mm3(圖1)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。激光多普勒血流儀監(jiān)測顯示，無論是45 min組還是60 min組，缺血過程中的血流下降程度以及再灌注過程中的血流恢復(fù)程度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.2 神經(jīng)功能評價(jià)神經(jīng)功能評分顯示，45 min及60 min缺血再灌注損傷均造成了顯著的神經(jīng)功能受損。45 min組神經(jīng)功能評分為(3.98±0.77)分，60 min組的神經(jīng)功能評分為(5.24±0.82)分，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 血腦屏障通透性的評價(jià)45 min和60 min缺血再灌注損傷均能造成明顯的血腦屏障破壞，表現(xiàn)為梗死側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯的伊文氏藍(lán)染色(圖3)。組織勻漿液分光光度法檢測伊文氏藍(lán)的濃度顯示，60 min組梗死側(cè)為(22.75±4.38)μg(伊文氏藍(lán))/g(腦組織)，對側(cè)為(3.24±1.77)μg/g。45 min組梗死側(cè)腦組織伊文氏藍(lán)含量為(11.36±2.92)μg/g，對側(cè)為(2.78±0.94)μg/g。缺血側(cè)與對側(cè)比較，以及60 min組的缺血側(cè)與45 min組的缺血側(cè)比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 TTC染色示梗死體積

圖2 多普勒血流監(jiān)測示血流下降和恢復(fù)的程度

圖3 伊文氏藍(lán)染色示血腦屏障破壞程度

2.4 神經(jīng)元凋亡水平的評價(jià)45 min和60 min腦缺血再灌注損傷后，在梗死周邊區(qū)可以觀察到明顯的神經(jīng)元凋亡，即Tunel和Neun雙染陽性的細(xì)胞。45 min組梗死側(cè)腦組織梗死周邊區(qū)Tunel陽性細(xì)胞率為(41.65±2.48)%，60 min組為(60.18±1.40)%，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見圖4。

2.5 氧化應(yīng)激水平的評價(jià)45 min和60 min缺血再灌注損傷后，在梗死周邊區(qū)可以檢測到大量4HNE和8OHDG陽性細(xì)胞，其中45 min組4HNE陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)為(43.27±6.43)個(gè)/200倍視野，60 min組4HNE陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)為(72.67±7.82)個(gè)/200倍視野，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。45 min組8OHDG陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)為(36.96±4.54)個(gè)/ 200倍視野，60 min組8OHDG陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)為(61.45±4.36)個(gè)/200倍視野，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

圖4 Tunel和Neun雙染示神經(jīng)元凋亡

圖54 HNE和8OHDG染色示氧化應(yīng)激水平

3 討論

本研究使用C57BL/6小鼠，建立了穩(wěn)定的小鼠腦缺血再灌注損傷模型，通過對比45 min缺血時(shí)間和60 min缺血時(shí)間，發(fā)現(xiàn)缺血時(shí)間的延長顯著地?cái)U(kuò)大了梗死體積，加重了神經(jīng)功能損傷，并導(dǎo)致了更為嚴(yán)重的血腦屏障破壞、神經(jīng)元凋亡以及氧化應(yīng)激損傷。

目前國內(nèi)研究腦缺血再灌注損傷大多使用大鼠模型，而隨著基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠越來越廣泛的應(yīng)用，穩(wěn)定的小鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立顯得尤為重要。通過本研究的實(shí)施，我們針對小鼠腦缺血再灌注損傷模型的成功建立總結(jié)了以下經(jīng)驗(yàn)。首先，小鼠具有體重小、相對體表面積較大的特點(diǎn)，在麻醉狀態(tài)下小鼠的體溫不易保持，而體溫對缺血損傷程度影響十分大。因此整個(gè)手術(shù)過程中應(yīng)該保持手術(shù)室恒溫，同時(shí)通過加熱墊維持小鼠體溫，并用肛溫計(jì)監(jiān)測整個(gè)手術(shù)過程中的小鼠體溫。其次，合適的手術(shù)設(shè)備的選擇十分重要。體視顯微鏡、較精細(xì)的顯微手術(shù)器械、硅膠材質(zhì)的具有一定彈性的線栓均是提高手術(shù)成功率的保障。第三，缺血區(qū)域腦血量流的監(jiān)測是保證模型穩(wěn)定的關(guān)鍵。激光多普勒血流測定是一種無創(chuàng)的血流監(jiān)測手段，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測特定區(qū)域的血流供應(yīng)情況。雖然用于實(shí)驗(yàn)的小鼠的周齡和體重均經(jīng)過了嚴(yán)格的篩選，仍不能排除少數(shù)小鼠大腦中動(dòng)脈直徑存在個(gè)體差異，同時(shí)由于手術(shù)操作過程中存在的偶然因素，部分小鼠可能未能達(dá)到理想的血流阻斷以及血流再灌。此時(shí)，通過激光多普勒腦血流儀的監(jiān)測，可以將不符合實(shí)驗(yàn)要求的小鼠剔除，以保證模型的穩(wěn)定以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠。

本研究通過上述模型制備方法，建立了45 min缺血和60 min缺血兩組小鼠腦缺血再灌注損傷模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，45 min和60 min的缺血引起了明顯的腦梗死和神經(jīng)功能損傷。缺血時(shí)間的延長顯著地增加了梗死體積并導(dǎo)致了神經(jīng)功能的惡化。血腦屏障的破壞是腦缺血再灌注損傷的重要標(biāo)志，是氧自由基、炎癥因子、金屬蛋白酶等共同作用的結(jié)果。本研究通過伊文氏藍(lán)能夠通過破壞的血腦屏障滲透進(jìn)入腦組織的原理，檢測兩組小鼠血腦屏障破壞的情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺血時(shí)間的延長會(huì)顯著導(dǎo)致血腦屏障破壞程度的加重。

缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的凋亡是引起神經(jīng)功能損傷和腦梗死體積擴(kuò)大的主要原因。細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA，基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下連接上熒光素標(biāo)記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡檢測，即Tuenl染色。Tunel染色是目前國際上公認(rèn)的凋亡細(xì)胞標(biāo)測方法。本研究通過Tunel和神經(jīng)元標(biāo)志物Neun的雙染，檢測了梗死周邊區(qū)神經(jīng)元的凋亡水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺血時(shí)間的延長顯著增加了凋亡細(xì)胞的比例。

氧化應(yīng)激是缺血再灌注時(shí)引起細(xì)胞損傷的一個(gè)重要病理機(jī)制。氧自由基可以直接損傷細(xì)胞的核酸以及細(xì)胞膜的脂質(zhì)從而引起細(xì)胞的死亡。8OHDG和4HNE是反映氧化應(yīng)激水平的兩個(gè)重要標(biāo)志。8OHDG是DNA氧化損傷的標(biāo)志物，4NHE則是脂質(zhì)氧化損傷的標(biāo)志物[9]。本研究通過8OHDG和4HNE的免疫熒光染色證實(shí)在缺血側(cè)的腦組織中存在大量的氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞。60 min缺血時(shí)間相對45 min缺血時(shí)間，顯著加重了氧化應(yīng)激損傷的程度。

綜上所述，本研究摸索、建立了一種穩(wěn)定的小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，證實(shí)了缺血時(shí)間的延長能顯著加重腦缺血再灌注損傷的程度，具體表現(xiàn)在梗死體積增大、神經(jīng)功能損傷加重以及血腦屏障破壞程度加劇這三個(gè)方面。缺血時(shí)間的延長還增加了缺血腦組織神經(jīng)元的凋亡和氧化應(yīng)激損傷。本研究將為今后以小鼠為實(shí)驗(yàn)對象的腦缺血再灌注損傷研究提供重要的技術(shù)參考。

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Establishment and evaluation of a murine cerebral ischemia-reperfusion model.

WANG Lang1,2,LU Yan-yun2, ZHOU Qin3,SHUI Xiao-lan1.1.Department of Cardiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060, Hubei,CHINA;2.Cardiovascular Research Institute of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;3.Department of Neurology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo establish a murine cerebral ischemia-reperfusion model and a scientific evaluation system for the model,and to evaluate the effect of prolonged ischemia time on ischemia reperfusion injury.MethodsTransient middle cerebral artery occlusion was used for establishing the murine cerebral ischemia-reperfusion model.Neurological score,TTC staining,Evan's blue staining,Tunel staining and immunofluorescence technique were used to compare the infarct volume,neurological deficit,blood brain barrier(BBB)disruption,neuronal apoptosis and oxidative injury between 45 min ischemia and 60 min ischemia.ResultsCompared with 45 min ischemia,60 min ischemia increased infarct volume by 78.21%,neurological score by 31.66%,neuronal apoptosis rate by 44.49%,and significantly exacerbated BBB disruption and oxidative injury.ConclusionStrict operation and rigorous intraoperative monitoring can obtain stable murine ischemia-reperfusion injury model.Prolonged ischemic time led to worsened brain injury.

Cerebral ischemia-reperfusion;Apoptosis;Oxidative stress;Mice

R-332

A

1003—6350（2014）20—2965—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.20.1168

2014-08-13)

國家自然科學(xué)基金（編號：81100230）；國家科技支撐項(xiàng)目（編號：2011BAI15B02、2012BAI39B05）

王朗。E-mail：wlang81@gmail.com