姚增武，仲蓓，王東升，曹守根，王松，周巖冰

（1 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院普外科，山東 青島 266003； 2 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院高壓氧科； 3 淄博市淄川區(qū)人民醫(yī)院）

人類胃腸道存在大約1014個細菌，種類超過了1 000種。腸道細菌在營養(yǎng)吸收及代謝、維生素的產(chǎn)生、病原體的抵抗以及免疫系統(tǒng)的形成和維持等生理功能上發(fā)揮重要的作用。因腸道細菌的多樣性和功能的豐富性，有人甚至將腸道細菌比作人體的一個“器官”［1－3］。研究表明，抗生素對于人類腸道菌群的平衡有重要的影響［4］。但上述研究通常采用的是細菌培養(yǎng)基的方法，這種方法只能確定20%～40%的腸道細菌的種類，有很大的局限性。近年來，16SrDNA基因高通量測序方法的發(fā)展使得我們可以檢測到絕大多數(shù)的腸道細菌［5］。本研究通過采用16SrDNA基因測序這種更準確的技術，旨在明確廣譜抗生素對大鼠腸道菌群多樣性的影響。?

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性 Wistar大鼠（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供）24只，8周齡，體質(zhì)量（250±10）g。實驗動物飼養(yǎng)于我院動物實驗室，普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水，于（23±2）℃和相對濕度為（50±5）%的無特殊病原體環(huán)境下飼養(yǎng)1周以適應環(huán)境。

1.1.2 試劑及藥物 注射用頭孢唑林鈉（武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司）；糞便基因組DNA快速提取試劑盒及DNA Marker（北京百泰克生物技術有限公司）；Premix Taq Version 2.0（Takara生物技術有限公司）。電泳緩沖液的配制：將Tris 242g、Na2EDTA·2H2O 37.2g，置于1L燒杯中，向燒杯中加入約800mL的去離子水，充分攪拌溶解，加入57.1mL的乙酸，充分攪拌，加去離子水將溶液定容至1L后，室溫下保存。瓊脂糖溶液的配制：稀釋100mL的5×TBE溶液至500mL，取100mL溶解3g瓊脂糖，煮沸，混勻直至沒有氣泡，冷卻至60℃時加入10g／L EB 5μL，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的電泳板中，室溫放置45min。

1.2 研究方法

1.2.1 動物分組及處理 將 Wistar大鼠24只隨機分為一次應用抗生素組（A組）、多次應用抗生素組（B組）和對照組（C組），每組均為8只。A組：第一天按100mg／kg劑量腹腔注射頭孢唑林鈉，第2、3天分別用等量的生理鹽水腹腔注射一次；B組：按100mg／kg劑量腹腔注射頭孢唑林鈉，并且連續(xù)用藥3d；C組：腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)3d。

1.2.2 糞便標本的收集及保存 收集3組大鼠用藥前1d和用藥結束后第1次糞便（大于2g）于無菌容器中，－80℃保存。

1.2.3 糞便標本DNA的提取 糞便標本解凍以后，按照糞便基因組DNA快速提取試劑盒的操作手冊逐步操作，提取細菌DNA。

1.2.4 細菌DNA的擴增 進行細菌16SrDNA V3可變區(qū) PCR 擴增，引物選擇338F／533R（5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3′／5′ TTACCGCGGCTGCTGGCAC3′，深圳華大基因科技公司合成），試劑選擇Premix Taq。PCR擴增反應條件：94℃預變性5min；94℃30s，58℃45s，72℃1 min，共20個循環(huán)；最后72℃延伸10min。采用Qubit Fluorometer及瓊脂糖凝膠電泳定量檢測樣本質(zhì)量，選擇DNA濃度均大于50mg／L、總量大于3ng的24份樣品進行16SrDNA基因高通量測序。

1.2.5 細菌16SrDNA測序分析 用16SrDNA的高可變區(qū)Illumina測序技術，對樣品的16SrDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物進行測序，得到原始的數(shù)據(jù)和reads。將reads進行去除接頭序列、低復雜度序列和低質(zhì)量序列的處理。將含有上述序列的reads去掉后，得到每個樣品的Clean Data。對于這些reads進行Overlap拼接，形成目標序列Tag。對Tag序列進行去冗余處理，挑選出Unique Tag序列。將Unique Tag序列按照豐度從高到低排序，然后按照0.02的差異（或98%的相似度）進行預聚類。預聚類后的Tags在0.03距離下（或97%的相似度）計算OTU數(shù)量，并采用眾數(shù)原則對每個OTU進行物種注釋，即首先統(tǒng)計該OTU中所有Tags的物種注釋信息，如果66%的Tags都支持同一個物種分類單元，那么該物種分類就作為該OTU的物種分類信息。

1.2.6 腸道細菌多樣性指數(shù) 根據(jù)每個樣品中的OTU總數(shù)和每個OTU的相對豐度進行樣品多樣性指數(shù)的計算。Chao1和ACE指數(shù)是根據(jù)所測得OTU的數(shù)量來預測樣品中微生物種類，其值越大，物種越豐富；Shannon和Simpson指數(shù)是基于樣品的所有OTU豐度和均勻度及其注釋物種信息，反映腸道菌群中所有物種的種類數(shù)及每個物種個體數(shù)占群落中總個體數(shù)比例，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越接近于0，表示樣品中物種越豐富。

1.3 統(tǒng)計學處理

16SrDNA的基因測序分析采用Mothur V.1.11.0軟件進行處理。計量資料以表示，數(shù)據(jù)間比較采用配對t檢驗和成組t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

對24份糞便樣本DNA的16SrDNA V3區(qū)進行Illumina測序，得到約8.24Gb的原始數(shù)據(jù)。每個樣本產(chǎn)出約33 000條reads，經(jīng)過去除接頭序列、低復雜度序列和低質(zhì)量序列后，每個樣本大約得到了80%的Clean Data。將這些reads進行Overlap拼接，得到的Tag序列，其長度分布在134、152和157bp左右，這與多數(shù)細菌V3區(qū)域的長度是一致的。所有樣本預聚類后的Tags在0.03距離下得出OTU數(shù)量為1 859±208。24份樣品均有多于80%的Tag序列能夠注釋到“目”的水平，而能夠注釋到“科”的水平的Tag序列低于60%，選擇“目”作為24份樣品的最佳分類水平。

2.1 各組腸道菌群Chao1、ACE指數(shù)變化

A、B組腸道菌群OTU的Chao1、ACE指數(shù)用藥后較用藥前降低，差異均有統(tǒng)計學意義（t＝5.3～12.7，P＜0.05）；C 組用藥后腸道菌群 OTU 的Chao1、ACE指數(shù)變化無顯著性（P＞0.05）。B組Chao1、ACE指數(shù)降低較 A 組更明顯（t＝5.6、5.3，P＜0.05）。見表1、2。

2.2 各組腸道菌群Shannon、Simpson指數(shù)變化

A、B組大鼠腸道菌群Shannon指數(shù)用藥后較用藥前顯著降低（t＝7.6、12.4，P＜0.05），C組用藥后腸道菌群Shannon指數(shù)變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；B組的Shannon指數(shù)降低較A組更明顯（t＝－4.1，P＜0.05）。見表3。A、B組腸道菌群Simpson指數(shù)用藥后較用藥前均顯著升高（t＝4.4、9.5，P＜0.05），C組用藥后腸道菌群Simpson指數(shù)變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；B組的Simpson指數(shù)升高較A組更明顯（t＝5.7，P＜0.05）。見表4。

表1 各組OTU的Chao1指數(shù)用藥前后的變化（）

表1 各組OTU的Chao1指數(shù)用藥前后的變化（）

與用藥前比較，＊t＝5.3、12.7，P＜0.05。

組別 用藥前 用藥后 差值A組 5 303.9±292.7 5 103.0±276.9＊ 200.9± 93.5 B組 5 169.8±265.4 4 670.1±239.5＊ 499.6±119.8 C組5 264.1±363.1 5 240.0±368.3 24.1± 95.1

表2 各組OTU的ACE指數(shù)用藥前后的變化（）

表2 各組OTU的ACE指數(shù)用藥前后的變化（）

與用藥前比較，＊t＝6.2、11.2，P＜0.05。

組別 用藥前 用藥后 差值A組 10 108.9±541.3 9 725.8±468.0＊ 383.1±175.3 B組 10 295.9±458.6 9 360.5±467.9＊ 935.4±236.8 C組10 597.9±761.0 10 539.4±755.3 58.5±156.7

表3 各組OTU的Shannon指數(shù)用藥前后的變化（）

表3 各組OTU的Shannon指數(shù)用藥前后的變化（）

與用藥前比較，＊t＝7.6、12.4，P＜0.05。

組別 用藥前 用藥后 差值A組 4.323±0.274 2.805±0.585＊ 1.519±0.563 B組 4.101±0.302 1.370±0.685＊ 2.731±0.623 C組4.245±0.280 4.203±0.318 0.041±0.172

表4 各組OTU的Simpson指數(shù)用藥前后的變化（）

表4 各組OTU的Simpson指數(shù)用藥前后的變化（）

與用藥前比較，＊t＝4.4、9.5，P＜0.05。

組別 用藥前 用藥后 差值A組 0.087±0.012 0.130±0.033＊ －0.043±0.027 B組 0.092±0.012 0.237±0.049＊ －0.146±0.044 C組0.088±0.011 0.091±0.013 －0.003±0.085

3 討 論

本研究采用16SrDNA的基因測序方法來觀察廣譜抗生素用藥時間長短對大鼠腸道菌群多樣性的破壞程度，高通量測序技術通過對腸道細菌的16S rDNA中高可變區(qū)序列的測序來確定腸道細菌種類和數(shù)目相對值，具有高準確度、高通量、高靈敏度、低成本等優(yōu)勢。采用的廣譜抗生素為臨床上常用的頭孢唑啉，其抗菌譜廣，對革蘭陽性球菌有良好的抗菌活性；同時模擬了胃腸外科手術中抗生素常用的劑量及用藥時間。結果顯示，即使一次應用抗生素也會造成大鼠腸道菌群多樣性的破壞，其特征性指數(shù)Chao1、ACE、Shannon降低，Simpson升高，而且抗生素的應用時間越長，腸道菌群多樣性的降低越顯著，而這些變化在對照組中卻不明顯。

NOVELLI等［6］研究結果顯示，支氣管炎病人分別應用頭孢克肟（8例）和頭孢呋辛（8例）治療10d，兩組病人腸道細菌的多樣性顯著下降，腸細菌和梭菌屬減少較為明顯，同時伴有腸球菌的增加；頭孢克肟組有4例病人的糞便培養(yǎng)出沙門菌，而頭孢呋辛組有2例病人的糞便培養(yǎng)出難辨梭狀芽胞桿菌。BRISMAR等［7］研究結果顯示，14例健康志愿者口服頭孢布坦10d，用藥前后其腸道菌群的多樣性發(fā)生了顯著下降，大腸桿菌和厭氧球菌數(shù)量明顯下降，而腸球菌數(shù)量明顯增加，其中6例志愿者在用藥后的糞便中發(fā)現(xiàn)了難辨梭狀芽胞桿菌。上述結果與本研究采用高通量測序方法所得的結果基本一致?？股氐膽每稍斐赡c道菌群紊亂，其紊亂的程度與抗生素種類的選擇、用藥時間的長短以及個體的敏感性等因素有關?？股剡^度應用極易造成腸道菌群多樣性的破壞，導致很多罕見菌或機會性感染細菌的增殖，從而導致抗生素相關性腸炎，最為典型的是難辨梭狀芽胞桿菌相關性腸炎，嚴重者可導致死亡［8－10］。

國際上各個國家都存在不同程度的抗生素應用不合理的問題，這在我國表現(xiàn)得尤為突出。黎沾良等［11］對我國118所三級綜合性醫(yī)院的圍手術期抗菌藥物使用狀況的調(diào)查結果顯示，不合理、不規(guī)范的現(xiàn)象十分突出，如抗菌藥物的使用率過高、抗菌藥物選擇不合理、聯(lián)合用藥及用藥時機不規(guī)范、用藥時間過長、用法用量不規(guī)范等。雖然小劑量短時間的抗生素應用可能未引起相關的癥狀（如腹瀉、發(fā)熱等），但是其腸道菌群多樣性可能已經(jīng)發(fā)生了變化，并且導致一些潛在致病菌的增殖，這都可能形成抗生素相關腸炎的潛在風險。臨床工作中，抗生素相關性腸炎的發(fā)生在胃腸道外科最為常見，這與圍手術期抗生素的應用、手術對于胃腸道黏膜屏障等的直接損傷、術前灌腸及禁食等相關，而圍手術期抗生素的應用則起到了主要的作用［12］?？股氐氖褂檬且话央p刃劍，最佳的效果是既能保證其抗感染的功效又能將其對腸道微生態(tài)平衡的破壞降至最低。因此在臨床工作中，應嚴格把握抗生素適應證及用法、用量，合理使用抗生素，避免過度使用。人體腸道細菌有一定的彈性，在抗生素使用后可不同程度地恢復［13］。本研究尚未觀察大鼠腸道菌群的恢復情況，將來有待于對大鼠腸道細菌的彈性及恢復性做進一步的研究。

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