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        hUCMSCs并西格列汀對(duì)糖尿病大鼠肝臟蛋白激酶B表達(dá)影響

        2014-05-01 02:33:14聶靜王顏剛
        精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)雜志 2014年1期
        關(guān)鍵詞:西格列汀葡萄糖

        聶靜,王顏剛

        (青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,山東 青島 266071)

        間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是多潛能、自我更新細(xì)胞,能分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子和免疫調(diào)節(jié)因子,參與各種組織器官的修復(fù)[1-3],近年來(lái) MSCs在糖尿病治療方面作用引起了全球廣泛關(guān)注。而人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)具有來(lái)源豐富、采集簡(jiǎn)便、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn),成為MSCs臨床應(yīng)用最有前途的細(xì)胞來(lái)源之一[4]。本研究選擇雄性 Wistar大鼠制備鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型,靜脈應(yīng)用hUCMSCs及聯(lián)合西格列汀進(jìn)行干預(yù),觀察其對(duì)大鼠肝臟蛋白激酶B(AKT)表達(dá)的影響。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

        1 材料和方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        取8周齡健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠32只,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。hUCMSCs來(lái)源于我院中美干細(xì)胞中心,其需氧菌、厭氧菌、真菌、支原體等微生物檢測(cè)結(jié)果均為陰性,細(xì)胞表面抗原檢測(cè)符合MSCs的表型特征:CD34-,CD45-,HLA-DR-,CD90+,CD105+,用PBS稀釋至細(xì)胞密度為0.5×109/L。主要試劑如下:DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、5g/L胰酶、STZ,美國(guó)Sigma公司;青霉素及鏈霉素、PBS,西安沃爾森生物技術(shù)有限公司;高糖高脂飼料,北京華阜康生物科技股份有限公司;兔抗鼠AKT單克隆抗體,美國(guó)Proteintech公司;DAB顯色試劑盒,武漢博士德公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為糖尿病組(24只)及正常對(duì)照組(8只)。糖尿病組先給予高糖高脂飲食6周,然后給予小劑量STZ(30mg/kg)腹腔注射,10d后連續(xù)兩次檢測(cè)空腹血糖≥11.1mmol/L即認(rèn)為造模成功,成模后給予普通飼料喂養(yǎng)。正常對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 將成功建模后的糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組、hUCMSCs組以及hUCMSCs聯(lián)合西格列汀治療組(聯(lián)合組),每組8只。hUCMSCs組:分別在成模后第1、5周給予大鼠尾靜脈注射hUCMSCs,每只2mL(1.0×106個(gè)細(xì)胞);聯(lián)合組:造模成功后開(kāi)始給予大鼠西格列汀10mg/(kg·d)灌胃治療10周,分別在造模成功后第1、5周給予大鼠尾靜脈注射hUCMSCs治療,每只2mL(1.0×106個(gè)細(xì)胞);正常對(duì)照組與糖尿病對(duì)照組不予治療。

        1.2.3 肝臟組織AKT表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行檢測(cè)。成模后第10周處死各組大鼠,取出肝臟組織,置于40g/L甲醛溶液中固定24h,脫水、石蠟包埋、切片,行免疫組化染色檢測(cè),光學(xué)顯微鏡下(200倍)觀察各組AKT胞漿著色情況,每張圖片觀察4個(gè)視野。AKT定位于細(xì)胞質(zhì),無(wú)背景著色情況下均以細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色顆粒者為陽(yáng)性。免疫組化染色結(jié)果采用半定量評(píng)分方法判定:①計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并賦予分值,≤5%為0分,6%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分;②觀察著色強(qiáng)度并賦予分值,無(wú)色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。以陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分值與著色強(qiáng)度分值乘積判定結(jié)果:0分為(-),1~4分為(+),5~8分為(),9~12分為()。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)間比較采用秩和檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        聯(lián)合組及hUCMSCs組肝臟組織AKT表達(dá)均明顯高于糖尿病對(duì)照組,但低于正常對(duì)照組,差異有顯著性(Hc=25.085,q=3.211~9.275,P<0.05),聯(lián)合組高于hUCMSCs組(q=5.967,P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

        表1 各組大鼠肝臟組織AKT表達(dá)比較(n=8,只)

        3 討 論

        AKT信號(hào)通路是胰島素主要的下游分子通路。AKT通過(guò)對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖原合成、糖酵解和糖異生的調(diào)節(jié)及其基因突變、沉默、敲除和AKT酶活性改變,影響著葡萄糖的代謝及糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。AKT磷酸化通過(guò)胰島素依賴的方式進(jìn)行,可在三個(gè)水平上調(diào)控葡萄糖代謝。①AKT通過(guò)誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1和GLUT3的表達(dá)及GLUT4向質(zhì)膜的移位促進(jìn)葡萄糖攝??;此外,AKT通過(guò)增加內(nèi)吞影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),從而維持血糖穩(wěn)定[5]。②通過(guò)糖原合成酶激酶3(GSK3)促進(jìn)糖原合成。③通過(guò)磷酸果糖激酶2(6-PF2-K)誘導(dǎo)糖酵解。AKT調(diào)控嚴(yán)密精確,其調(diào)控紊亂可引起多種疾病,如糖尿病等。已有研究顯示,AKT敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)糖尿病,并且胰島素靶組織對(duì)葡萄糖利用減少[6]。BAE等[7]研究顯示,在AKT基因敲除的脂肪細(xì)胞中,通過(guò)過(guò)表達(dá)AKT的方式,可以恢復(fù)正常胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取。

        近年來(lái),MSCs在糖尿病治療方面作用引起了廣泛關(guān)注。多項(xiàng)研究已經(jīng)證明,MSCs在體外胰島細(xì)胞培養(yǎng)條件誘導(dǎo)下,具有向胰島素分泌細(xì)胞分化的潛能,表達(dá)與功能性胰島β細(xì)胞生成相關(guān)的多個(gè)基因,并能以葡萄糖依賴方式釋放胰島素,移植到體內(nèi)能使STZ誘導(dǎo)的裸鼠糖尿病癥狀減輕[8-10]。在各種來(lái)源的MSCs中,hUCMSCs因具有來(lái)源豐富、易于獲得、采集簡(jiǎn)便、免疫原性低等優(yōu)勢(shì),具有更廣泛的應(yīng)用與研究?jī)r(jià)值[11-13]。而西格列?。―PP-4抑制劑)能夠通過(guò)減少GLP-1在體內(nèi)的降解而降低血糖水平,已廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療[14]。肝臟是胰島素作用的重要靶組織,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,hUCMSCs組及hUCMSCs聯(lián)合西格列汀組大鼠肝臟組織中AKT的表達(dá)均明顯高于糖尿病對(duì)照組,表明hUCMSCs移植能改善糖尿病引起的AKT表達(dá)降低。西格列汀可能通過(guò)減少GLP-1在體內(nèi)的降解而降低血糖,從而加強(qiáng)hUCMSCs改善糖尿病大鼠由于血糖過(guò)高引起的AKT表達(dá)降低作用。

        圖1 各組大鼠肝臟AKT免疫組化染色結(jié)果

        綜上所述,hUCMSCs聯(lián)合西格列汀治療能改善因糖尿病引起的AKT表達(dá)降低,可能為2型糖尿病治療提供新思路。

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