趙文冰,孔心涓,姜英俊,趙文君
(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科,山東 青島 266003)
肝纖維化發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,多種因素如細(xì)胞、細(xì)胞因子及細(xì)胞信號通路等均參與其中。前期研究表明,Notch-1在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,且與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān)[1]。有研究結(jié)果證實(shí),EMT 參與肺[2]、腎[3]等纖維化過程,且鋅指蛋白(Snail-1)是EMT的關(guān)鍵因子。在肝纖維化中,Snail-1是否參與EMT過程,與Notch通路是否存在內(nèi)在聯(lián)系?目前尚需研究證實(shí)。為研究Notch通路、Snail-1在肝纖維化中的作用及兩者之間的聯(lián)系,本研究應(yīng)用四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,探討二者在肝纖維化中的作用與關(guān)系。
取雄性 Wistar大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,購于青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)10d,普通飲食。隨機(jī)分為對照組、模型組、藥物組,每組20只大鼠。
扶正化瘀干膏粉由上海黃海制藥有限責(zé)任公司提供,制備成含生藥46g/L的溶液。
Notch-1抗體、E-鈣黏素(E-cadherin)及兔抗鼠IgG抗體(PV-6002)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Notch配體(Jagged-1)抗體、Snail-1抗體及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體購自博奧森生物技術(shù)有限公司。
1.4.1 模型制備 將CCL4溶液與橄欖油以4∶6配成體積分?jǐn)?shù)0.40的油劑(模型組及藥物組皮下注射CCL4油劑,首劑量5mL/kg,以后3mL/kg),對照組大鼠皮下注射等劑量橄欖油,每周2次,共8周。造模開始藥物組以扶正化瘀方溶液4.6g/kg灌胃,灌胃容積為10mL/kg(劑量相當(dāng)于體質(zhì)量為60kg成人每千克體質(zhì)量用量的10倍);對照組及模型組以相同容積的生理鹽水灌胃,每天1次,共8周。每周稱體質(zhì)量1次,觀察動物一般狀況及毛發(fā)的變化。
1.4.2 樣本的采集及處理 實(shí)驗(yàn)8周末,大鼠禁食12h,水合氯醛腹腔注射麻醉,取每只大鼠肝右葉相同部位組織1塊,置入40g/L的中性甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋。
1.4.3 肝臟組織病理學(xué)檢查 肝組織石蠟包埋,連續(xù)2μm厚切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,每張切片隨機(jī)選5個不重疊視野,光學(xué)顯微鏡下觀察,肝纖維化的分級按照2000年(西安)修訂的肝臟病理組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[4]。
1.4.4 免疫組織化學(xué)染色 切片置于60℃烤箱過夜,二甲苯脫蠟,乙醇梯度水化;蒸餾水沖洗2min,分別入pH 9.0 的 EDTA 修復(fù)液(Jagged-1、Snail-1、α-SMA)與pH 6.0枸櫞酸鹽修復(fù)液(Notch-1、E-cadherin)中,置于高壓鍋內(nèi)130℃修復(fù)100s后自然涼干;分別置入體積分?jǐn)?shù)0.03的過氧化氫溶液10min,PBS(pH 7.4)沖洗4次,每次1.5min;分別加一抗 Jagged-1(1∶150)、Snail-1(1∶50)、α-SMA(1∶150)、Notch-1(1∶100)、E-cadherin(1∶100),放入37℃恒溫水浴箱孵育60min;PBS(pH 7.4)沖洗4次;加二抗37℃孵育20min,PBS(pH 7.4)沖洗4次,DAB顯色,蘇木精復(fù)染;梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片;鏡檢。
1.4.5 肝組織中各種蛋白表達(dá)的檢測 取5個較好的高倍視野,按顯色程度的深淺計分。1分:弱陽性,2分:陽性,3分:強(qiáng)陽性。按著色細(xì)胞百分比計分。1分:≤25%,2分:26%~50%,3分:51%~75%,4分:≥76%。然后計算顯色指數(shù)。顯色指數(shù)=顯色程度計分×著色細(xì)胞百分比計分,取其均數(shù)作為每個指標(biāo)的最終顯色指數(shù),采用雙盲法閱片。
以PPMS 1.5[5]統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,計量資料以表示,多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn);兩個變量之間的相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析,以P<0.05為差異有顯著性。
對照組大鼠狀況良好,行為與飲食量正常,毛發(fā)白色有光澤,體質(zhì)量增加。模型組注射CCL4后,活動逐漸減少,精神萎靡,嗜睡,攝食少,體質(zhì)量增長緩慢,毛發(fā)暗黃,注射CCL4部位潰瘍、結(jié)痂,周圍毛發(fā)脫落,部分大鼠有腹水形成。藥物組一般狀態(tài)及注射CCL4部位潰瘍愈合能力好于模型組。造模期間模型組大鼠死亡3只,藥物組大鼠死亡1只。
2.2.1 肉眼觀察 對照組大鼠肝表面光滑,顏色鮮紅,肝包膜完整,質(zhì)軟,邊緣銳利;模型組大鼠肝表面凹凸不平,有結(jié)節(jié)形成,顏色灰白,質(zhì)硬;藥物組肝臟大,邊緣鈍圓,肝表面有細(xì)顆粒形成,觸之粗糙,顏色暗紅,質(zhì)韌。
2.2.2 HE染色 對照組大鼠肝細(xì)胞呈單核,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列,無炎癥細(xì)胞浸潤(圖1A)。模型組肝小葉失去正常結(jié)構(gòu),肝細(xì)胞索排列紊亂,細(xì)胞廣泛的脂肪變性、壞死,炎性細(xì)胞浸潤;匯管區(qū)纖維組織大量增生,匯管區(qū)或中央靜脈區(qū)伸出纖維條索包繞肝組織,形成假小葉(圖1B)。藥物組肝細(xì)胞脂肪變性,匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤,纖維組織中度增生,有保存較完整的肝組織結(jié)構(gòu)(圖1C)。
2.2.3 大鼠肝組織中各種蛋白的表達(dá) 大鼠肝組織中Jagged-1、Notch-1、Snail-1、α-SMA 蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色著色,細(xì)胞核呈淡藍(lán)色著色。E-cadherin蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜,呈黃色或棕黃色著色。與對照組相比,模型組肝組織Jagged-1、Notch-1、Snail-1、α-SMA表達(dá)水平明顯升高,E-cadherin表達(dá)水平明顯下降,差異有顯著意義(F=190.415~608.534,q=26.691~48.437,P<0.01)。與模型組比較,藥物組大鼠肝組織內(nèi)Jagged-1、Notch-1、Snail-1、α-SMA 表達(dá)水平下降,E-cadherin表達(dá)水平升高,差異有顯著性(q=8.336~33.962,P<0.01)。見表1。
圖1 各組肝組織形態(tài)學(xué)改變
表1 各組大鼠肝組織中各種蛋白質(zhì)的表達(dá)()
表1 各組大鼠肝組織中各種蛋白質(zhì)的表達(dá)()
與對照組比較,F(xiàn)=190.415~608.534,#q=26.691~48.437,P<0.01;與模型組比較,*q=8.336~33.962,P<0.01。
-SMA對照組 20 2.97±0.48 1.76±0.56 3.18±0.37 8.07±1.49 2.23±0.44模型組 17 7.95±1.05# 9.37±0.95# 9.68±0.80# 1.65±0.55# 9.44±0.96#藥物組 19 4.32±0.58* 3.97±0.45* 5.85±0.75* 3.68±0.72* 5.43±1.06組別 n Jagged-1 Notch-1 Snail-1 E-cadherin α*
Jagged-1與 Notch-1、Snail-1及α-SMA 表達(dá)呈正相關(guān),與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.82~0.94,P<0.01);Notch-1與 Snail-1、α-SMA 表達(dá)呈正相關(guān),與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.83~0.95,P<0.01);Snail-1與α-SMA 表達(dá)呈正相關(guān),與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.95、-0.85,P<0.01),E-cadherin與 α-SMA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.88,P<0.01)
近年來研究顯示,Notch通路調(diào)控異常影響肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。在哺乳動物胚胎時期,肝組織中Notch通路表達(dá)活躍,當(dāng)肝臟分化發(fā)育成熟后,Notch通路在肝組織幾乎不表達(dá),而在膽管閉鎖引起的肝硬化及原發(fā)性膽汁性肝硬化病人肝組織中,Notch通路被重新激活[6-7]。葉超等[8]研究結(jié)果顯示,Jagged-1、Notch-1可能參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展,并與嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過8周造模后,HE染色結(jié)果顯示,模型組肝小葉失去正常結(jié)構(gòu),匯管區(qū)纖維組織大量增生,包繞肝組織,形成假小葉。免疫組化檢測結(jié)果顯示,Jagged-1、Notch-1、Snail-1、α-SMA蛋白表達(dá)于胞質(zhì),呈棕黃色著色,E-cadherin在細(xì)胞膜幾乎不表達(dá),提示造模成功。但Notch通路通過哪些具體的分子機(jī)制介導(dǎo)肝纖維化發(fā)生、發(fā)展,目前尚不清楚。
已有研究結(jié)果顯示,肝纖維化與EMT過程息息相關(guān)[9-10]。EMT是指肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、膽管細(xì)胞等在各種生理、病理情況下失去細(xì)胞之間的黏附分子E-cadherin,獲得間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白(α-SMA、波形絲蛋白、纖維連接蛋白),并轉(zhuǎn)變成為肌成纖維細(xì)胞,此細(xì)胞可持續(xù)產(chǎn)生Ⅳ膠原并沉積于肝組織中,致肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂,肝纖維化發(fā)生的過程。Snail-1在 EMT中起著關(guān)鍵作用[11-12],Snail基因含有一個CAGGTG核心,可與E-cadherin啟動子上的E-box元件結(jié)合,抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄,使E-cadherin表達(dá)下降,α-SMA表達(dá)上升。那么在肝纖維化組織中,Notch通路是否與Snail-1及EMT過程有關(guān)聯(lián)?對TGF-β與Ang-Ⅱ聯(lián)合誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞及體外培養(yǎng)的永生內(nèi)皮細(xì)胞系的研究顯示,過度表達(dá)Notch-1誘導(dǎo)Snail-1高表達(dá),抑制E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄,增加α-SMA表達(dá),同時伴隨細(xì)胞間接觸消失,成纖維細(xì)胞生成[13-14]。給予 Notch-1及Snail-1抑制劑將會抑制EMT過程。因此,我們推測在肝纖維組織中也可能存在類似的結(jié)果。
本實(shí)驗(yàn)檢測3組大鼠肝組織Jagged-1、Notch-1、Snail-1、E-cadherin、α-SMA的表達(dá),結(jié)果顯示,模型組肝細(xì)胞膜上E-cadherin幾乎不表達(dá),Jagged-1、Notch-1、Snail-1 及α-SMA在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過度表達(dá);而對照組肝細(xì)胞膜上E-cadherin表達(dá)量極高,相反其余4項(xiàng)在肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)水平低下。經(jīng)統(tǒng)計分析后顯示,Jagged-1、Notch-1與Snail-1表達(dá)水平呈正相關(guān),與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示Notch通路可能通過上調(diào)Snail-1的表達(dá)參與肝纖維化中EMT過程。
扶正化瘀方在治療纖維化方面已經(jīng)處于Ⅱ期臨床研究階段。扶正化瘀膠囊與維生素E聯(lián)合應(yīng)用,可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程,抑制腎纖維化發(fā)生[15]。本實(shí)驗(yàn)藥物組E-cadherin表達(dá)水平較模型組高,其余4項(xiàng)蛋白表達(dá)水平低于模型組,提示扶正化瘀方溶液可能通過抑制Notch通路及Snail-1的表達(dá),從而減輕肝纖維化的程度。
總之,我們認(rèn)為Notch通路通過上調(diào)Snail-1參與EMT過程,最終致肝纖維化發(fā)生、發(fā)展。抑制Notch通路可能是扶正化瘀方抑制肝纖維化進(jìn)展機(jī)制之一。對于Notch通路及Snail-1研究,可能有助于了解肝纖維化的發(fā)病機(jī)制,為尋找有效治療肝纖維化的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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