趙文冰，孔心涓，姜英俊，趙文君

（青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化科，山東 青島 266003）

肝纖維化發(fā)生機制復雜，多種因素如細胞、細胞因子及細胞信號通路等均參與其中。前期研究表明，Notch－1在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且與上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）密切相關(guān)［1］。有研究結(jié)果證實，EMT 參與肺［2］、腎［3］等纖維化過程，且鋅指蛋白（Snail－1）是EMT的關(guān)鍵因子。在肝纖維化中，Snail－1是否參與EMT過程，與Notch通路是否存在內(nèi)在聯(lián)系？目前尚需研究證實。為研究Notch通路、Snail－1在肝纖維化中的作用及兩者之間的聯(lián)系，本研究應(yīng)用四氯化碳（CCL4）誘導大鼠肝纖維化模型，探討二者在肝纖維化中的作用與關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

取雄性 Wistar大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購于青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)10d，普通飲食。隨機分為對照組、模型組、藥物組，每組20只大鼠。

1.2 藥物

扶正化瘀干膏粉由上海黃海制藥有限責任公司提供，制備成含生藥46g／L的溶液。

1.3 主要試劑

Notch－1抗體、E－鈣黏素（E－cadherin）及兔抗鼠IgG抗體（PV－6002）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Notch配體（Jagged－1）抗體、Snail－1抗體及α－平滑肌肌動蛋白（α－SMA）抗體購自博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制備 將CCL4溶液與橄欖油以4∶6配成體積分數(shù)0.40的油劑（模型組及藥物組皮下注射CCL4油劑，首劑量5mL／kg，以后3mL／kg），對照組大鼠皮下注射等劑量橄欖油，每周2次，共8周。造模開始藥物組以扶正化瘀方溶液4.6g／kg灌胃，灌胃容積為10mL／kg（劑量相當于體質(zhì)量為60kg成人每千克體質(zhì)量用量的10倍）；對照組及模型組以相同容積的生理鹽水灌胃，每天1次，共8周。每周稱體質(zhì)量1次，觀察動物一般狀況及毛發(fā)的變化。

1.4.2 樣本的采集及處理 實驗8周末，大鼠禁食12h，水合氯醛腹腔注射麻醉，取每只大鼠肝右葉相同部位組織1塊，置入40g／L的中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.4.3 肝臟組織病理學檢查 肝組織石蠟包埋，連續(xù)2μm厚切片，蘇木精－伊紅（HE）染色，每張切片隨機選5個不重疊視野，光學顯微鏡下觀察，肝纖維化的分級按照2000年（西安）修訂的肝臟病理組織學標準進行［4］。

1.4.4 免疫組織化學染色 切片置于60℃烤箱過夜，二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化；蒸餾水沖洗2min，分別入pH 9.0 的 EDTA 修復液（Jagged－1、Snail－1、α－SMA）與pH 6.0枸櫞酸鹽修復液（Notch－1、E－cadherin）中，置于高壓鍋內(nèi)130℃修復100s后自然涼干；分別置入體積分數(shù)0.03的過氧化氫溶液10min，PBS（pH 7.4）沖洗4次，每次1.5min；分別加一抗 Jagged－1（1∶150）、Snail－1（1∶50）、α－SMA（1∶150）、Notch－1（1∶100）、E－cadherin（1∶100），放入37℃恒溫水浴箱孵育60min；PBS（pH 7.4）沖洗4次；加二抗37℃孵育20min，PBS（pH 7.4）沖洗4次，DAB顯色，蘇木精復染；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；鏡檢。

1.4.5 肝組織中各種蛋白表達的檢測 取5個較好的高倍視野，按顯色程度的深淺計分。1分：弱陽性，2分：陽性，3分：強陽性。按著色細胞百分比計分。1分：≤25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：≥76%。然后計算顯色指數(shù)。顯色指數(shù)＝顯色程度計分×著色細胞百分比計分，取其均數(shù)作為每個指標的最終顯色指數(shù)，采用雙盲法閱片。

1.5 統(tǒng)計學處理

以PPMS 1.5［5］統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗；兩個變量之間的相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般情況

對照組大鼠狀況良好，行為與飲食量正常，毛發(fā)白色有光澤，體質(zhì)量增加。模型組注射CCL4后，活動逐漸減少，精神萎靡，嗜睡，攝食少，體質(zhì)量增長緩慢，毛發(fā)暗黃，注射CCL4部位潰瘍、結(jié)痂，周圍毛發(fā)脫落，部分大鼠有腹水形成。藥物組一般狀態(tài)及注射CCL4部位潰瘍愈合能力好于模型組。造模期間模型組大鼠死亡3只，藥物組大鼠死亡1只。

2.2 大鼠肝組織病理學檢查

2.2.1 肉眼觀察 對照組大鼠肝表面光滑，顏色鮮紅，肝包膜完整，質(zhì)軟，邊緣銳利；模型組大鼠肝表面凹凸不平，有結(jié)節(jié)形成，顏色灰白，質(zhì)硬；藥物組肝臟大，邊緣鈍圓，肝表面有細顆粒形成，觸之粗糙，顏色暗紅，質(zhì)韌。

2.2.2 HE染色 對照組大鼠肝細胞呈單核，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，無炎癥細胞浸潤（圖1A）。模型組肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝細胞索排列紊亂，細胞廣泛的脂肪變性、壞死，炎性細胞浸潤；匯管區(qū)纖維組織大量增生，匯管區(qū)或中央靜脈區(qū)伸出纖維條索包繞肝組織，形成假小葉（圖1B）。藥物組肝細胞脂肪變性，匯管區(qū)炎性細胞浸潤，纖維組織中度增生，有保存較完整的肝組織結(jié)構(gòu)（圖1C）。

2.2.3 大鼠肝組織中各種蛋白的表達 大鼠肝組織中Jagged－1、Notch－1、Snail－1、α－SMA 蛋白主要表達于細胞質(zhì)，細胞質(zhì)呈棕黃色著色，細胞核呈淡藍色著色。E－cadherin蛋白主要表達于細胞膜，呈黃色或棕黃色著色。與對照組相比，模型組肝組織Jagged－1、Notch－1、Snail－1、α－SMA表達水平明顯升高，E－cadherin表達水平明顯下降，差異有顯著意義（F＝190.415～608.534，q＝26.691～48.437，P＜0.01）。與模型組比較，藥物組大鼠肝組織內(nèi)Jagged－1、Notch－1、Snail－1、α－SMA 表達水平下降，E－cadherin表達水平升高，差異有顯著性（q＝8.336～33.962，P＜0.01）。見表1。

圖1 各組肝組織形態(tài)學改變

表1 各組大鼠肝組織中各種蛋白質(zhì)的表達（）

表1 各組大鼠肝組織中各種蛋白質(zhì)的表達（）

與對照組比較，F(xiàn)＝190.415～608.534，＃q＝26.691～48.437，P＜0.01；與模型組比較，＊q＝8.336～33.962，P＜0.01。

－SMA對照組 20 2.97±0.48 1.76±0.56 3.18±0.37 8.07±1.49 2.23±0.44模型組 17 7.95±1.05＃ 9.37±0.95＃ 9.68±0.80＃ 1.65±0.55＃ 9.44±0.96＃藥物組 19 4.32±0.58＊ 3.97±0.45＊ 5.85±0.75＊ 3.68±0.72＊ 5.43±1.06組別 n Jagged－1 Notch－1 Snail－1 E－cadherin α＊

2.3 各組大鼠肝組織各項觀察指標間的相關(guān)性

Jagged－1與 Notch－1、Snail－1及α－SMA 表達呈正相關(guān)，與E－cadherin表達呈負相關(guān)（r＝－0.82～0.94，P＜0.01）；Notch－1與 Snail－1、α－SMA 表達呈正相關(guān)，與E－cadherin表達呈負相關(guān)（r＝－0.83～0.95，P＜0.01）；Snail－1與α－SMA 表達呈正相關(guān)，與E－cadherin表達呈負相關(guān)（r＝0.95、－0.85，P＜0.01），E－cadherin與 α－SMA表達呈負相關(guān)（r＝－0.88，P＜0.01）

3 討 論

近年來研究顯示，Notch通路調(diào)控異常影響肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。在哺乳動物胚胎時期，肝組織中Notch通路表達活躍，當肝臟分化發(fā)育成熟后，Notch通路在肝組織幾乎不表達，而在膽管閉鎖引起的肝硬化及原發(fā)性膽汁性肝硬化病人肝組織中，Notch通路被重新激活［6－7］。葉超等［8］研究結(jié)果顯示，Jagged－1、Notch－1可能參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，并與嚴重程度密切相關(guān)。本實驗經(jīng)過8周造模后，HE染色結(jié)果顯示，模型組肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，匯管區(qū)纖維組織大量增生，包繞肝組織，形成假小葉。免疫組化檢測結(jié)果顯示，Jagged－1、Notch－1、Snail－1、α－SMA蛋白表達于胞質(zhì)，呈棕黃色著色，E－cadherin在細胞膜幾乎不表達，提示造模成功。但Notch通路通過哪些具體的分子機制介導肝纖維化發(fā)生、發(fā)展，目前尚不清楚。

已有研究結(jié)果顯示，肝纖維化與EMT過程息息相關(guān)［9－10］。EMT是指肝細胞、肝星狀細胞、膽管細胞等在各種生理、病理情況下失去細胞之間的黏附分子E－cadherin，獲得間質(zhì)細胞特異性蛋白（α－SMA、波形絲蛋白、纖維連接蛋白），并轉(zhuǎn)變成為肌成纖維細胞，此細胞可持續(xù)產(chǎn)生Ⅳ膠原并沉積于肝組織中，致肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝纖維化發(fā)生的過程。Snail－1在 EMT中起著關(guān)鍵作用［11－12］，Snail基因含有一個CAGGTG核心，可與E－cadherin啟動子上的E－box元件結(jié)合，抑制E－cadherin轉(zhuǎn)錄，使E－cadherin表達下降，α－SMA表達上升。那么在肝纖維化組織中，Notch通路是否與Snail－1及EMT過程有關(guān)聯(lián)？對TGF－β與Ang－Ⅱ聯(lián)合誘導人腎小管上皮細胞及體外培養(yǎng)的永生內(nèi)皮細胞系的研究顯示，過度表達Notch－1誘導Snail－1高表達，抑制E－cadherin基因轉(zhuǎn)錄，增加α－SMA表達，同時伴隨細胞間接觸消失，成纖維細胞生成［13－14］。給予 Notch－1及Snail－1抑制劑將會抑制EMT過程。因此，我們推測在肝纖維組織中也可能存在類似的結(jié)果。

本實驗檢測3組大鼠肝組織Jagged－1、Notch－1、Snail－1、E－cadherin、α－SMA的表達，結(jié)果顯示，模型組肝細胞膜上E－cadherin幾乎不表達，Jagged－1、Notch－1、Snail－1 及α－SMA在肝細胞質(zhì)內(nèi)過度表達；而對照組肝細胞膜上E－cadherin表達量極高，相反其余4項在肝細胞質(zhì)內(nèi)表達水平低下。經(jīng)統(tǒng)計分析后顯示，Jagged－1、Notch－1與Snail－1表達水平呈正相關(guān)，與E－cadherin表達呈負相關(guān)。這些結(jié)果提示Notch通路可能通過上調(diào)Snail－1的表達參與肝纖維化中EMT過程。

扶正化瘀方在治療纖維化方面已經(jīng)處于Ⅱ期臨床研究階段。扶正化瘀膠囊與維生素E聯(lián)合應(yīng)用，可逆轉(zhuǎn)TGF－β1誘導的EMT過程，抑制腎纖維化發(fā)生［15］。本實驗藥物組E－cadherin表達水平較模型組高，其余4項蛋白表達水平低于模型組，提示扶正化瘀方溶液可能通過抑制Notch通路及Snail－1的表達，從而減輕肝纖維化的程度。

總之，我們認為Notch通路通過上調(diào)Snail－1參與EMT過程，最終致肝纖維化發(fā)生、發(fā)展。抑制Notch通路可能是扶正化瘀方抑制肝纖維化進展機制之一。對于Notch通路及Snail－1研究，可能有助于了解肝纖維化的發(fā)病機制，為尋找有效治療肝纖維化的藥物提供實驗依據(jù)。

［1］張秋霞，孔心涓.Notch通路在大鼠肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中作用的初探［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學生物學進展，2012，12（11）：2046－2048.

［2］DEVIPRIYA NAGARAJA，TAHIRA MELO，ZHIYONG DENG，et al.ERK／GSK3β／Snail signaling mediates radiationinduced alveolar epithelial－to－mesenchymal transition［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2011，10：3－5.

［3］YANG J，DAI C，LIU Y，et al.A Novel mechanism by which hepatocyte growth factor blocks tubular epithelial to mesenchymal transition［J］.Cell Biology，2005，16（1）：68－78.

［4］中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案［J］.中華內(nèi)科雜志，2001，40（1）：62－68.

［5］周曉彬，張建.醫(yī)學統(tǒng)計軟件PPMS 1.5的應(yīng)用舉例［J］.齊魯醫(yī)學雜志，2011，26（6）：502－505.

［6］張志波，胡傳兵，高紅，等.膽道閉鎖患兒肝組織細胞因子及相關(guān)基因表達的研究［J］.中華小兒外科雜志，2008，29（11）：667－670.

［7］NIJJAR S S，WALLACE L，CROSBY H A，et al.Altered Notch ligand expression in human liver disease：further evidence for a role of the Notch signaling pathway in hepatic neovascularization and biliary ductular defects［J］.Am J Pathol，2002，160（5）：1695－1703.

［8］葉超，陳永平，金曉芝，等.Notch／Jagged信號通路在肝纖維化大鼠模型中的動態(tài)表達及意義［J］.中華傳染病雜志，2011，29（2）：81－86.

［9］GREENBURG C，HAY E D.Epithelia suspended in collagen gels can lose polarity and express characteristics of migrating mesenchymal cells［J］.J Cell Biol，1982，95：333－339.

［10］YUE H Y，YIN C，HOU J L，et al.Hepatocyte nuclear factor 4alpha attenuates hepatic fibrosis in rats［J］.Gut，2010，59：236－246.

［11］ZEISBERG M，NEILSON E G.Biomarkers for epithelialmesenchymal transitions［J］.J Clin Invest，2009，119：1429－1437.

［12］KANG Y，MASSAGUE J.Epithelial－mesenchymal transitions：twist in development and metastasis［J］.Cell，2004，118：277－279.

［13］SAVAGNER P.Leaving the neighborhood：molecular mechanisms involved during epithelial－mesenchymal transition［J］.Bioessays，2001，23：912－923.

［14］TIMMERMAN L A，GREGO－BESSA J，RAYA A，et al.Notch promotes epithelial－mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation［J］.Genes Dev，2004，18（1）：99－115.

［15］WAN Q L，YUAN J L，TAO Y Y，et al.Fuzheng Huayu recipe and vitamin E reverse renal interstitial fibrosis through counteracting TGF－β1－induced epithelial－to－mesenchymal transition［J］.Journal of Ethnopharmacology，2010，127：631－640.