劉秀琴，于樹紅，孫立榮

（青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科，山東 青島 266003）

急性B淋巴細胞白血?。˙－ALL）是兒童常見急性白血病，病死率高，嚴重威脅病兒生命，迄今為止，其發(fā)病機制仍不明確？microRNA（miRNA）為一類由20～25個核苷酸組成的內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，主要參與基因轉錄后水平表達的調控［1］，其表達失調在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的調控作用［2－5］。microRNA－21（miR－21）為重要的致癌基因，已有研究顯示，miR－21在T淋巴細胞白血病和 NK 細胞 白 血 病 中 高 表 達［6－7］，miR－21高 表 達與前B細胞淋巴瘤的發(fā)病密切相關［8］。本研究用實時熒光定量PCR法，檢測B－ALL病兒miR－21表達水平及其化療前后變化，探討其在兒童B－ALL發(fā)生、預后中的意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2006年10月—2010年10月，取青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科及青島市市立醫(yī)院小兒科初診BALL病兒36例，男15例，女21例；年齡1～14歲，平均7.5歲；其中高危型13例，標危型23例。按細胞形態(tài)學、免疫表型、遺傳學、分子生物學（MICM）診斷標準確診，經(jīng)流式細胞術檢測均為B－ALL。病兒均給予長春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶和強的松（VDLP）方案化療，分別于化療前及化療后第2周末采集骨髓？臨床2個療程內(nèi)完全緩解（CR）者為體內(nèi)敏感；臨床2個療程不緩解者，骨髓白血病細胞下降指數(shù)（MBDI）≥60%為體內(nèi)敏感，＜60%為體內(nèi)耐藥。MBDI＝（化療前骨髓白血病細胞（%）－化療后骨髓白血病細胞（%））／化療前骨髓白血病細胞（%）×100%？以骨髓常規(guī)正常的非造血系統(tǒng)疾病病兒12例為對照組，近期未應用過糖皮質激素及其他免疫抑制劑，其中男8例，女4例；年齡1～12歲，平均6.5歲？

1.2 miR－21表達檢測

1.2.1 骨髓單個核細胞（BMMCs）的分離 取骨髓5mL，EDTA抗凝，用生理鹽水稀釋3～4倍，然后將其緩慢加至Ficoll淋巴細胞分離液4mL中（相對密度1.077），以2 000r／min離心16min？取界面層得BMMCs，用生理鹽水洗滌3次，以2×108／L的密度接種于含150g／L新生牛血清（Hyclone公司）的RPMI－1640培養(yǎng)液（美國GibcoBRL公司，內(nèi)含有100kU／L青霉素和100kU／L鏈霉素）中，置37℃、體積分數(shù)0.05CO2和全濕條件下培養(yǎng)？

1.2.2 總RNA的提取及實時熒光定量PCR檢測按Trizol（Invitrogen公司）試劑說明書提取細胞總RNA，為增加miRNA獲得率，將異丙醇沉淀步驟改為－20℃沉淀2h以上。檢測RNA溶液吸光度（A）值，A260／A280值＞1.8方可用于檢測。加poly（A）尾后，應用M－MLV反轉錄酶（Invitrogen公司）進行逆轉錄反應，以Oligo（dT）為引物，反應條件如下：16℃30min，37 ℃ 30min，70 ℃ 10min，4 ℃10min。以制備的cDNA為模板，以U6作為內(nèi)參，實時熒光定量PCR法在Roche定量PCR儀上進行擴增，miR－21 上 游 引 物 為：5′－AAAGTTGTAGTCAGACTATTCGAT－3′，下游引物為：5′－GCTGTCAACGATACGCTACGT－3′。所有樣品做3個復孔，總反應體系20μL，設定反應條件為：95℃預變性30s，95℃變性5s，55℃退火5s，72℃延伸15s。按照文獻［9］比較閾值法，讀取Ct值，用公式2－△△Ct計算目的基因miR－21的表達水平?！鳌鰿t＝（實驗組 Ct目的基因－ 實驗組 Ct管家基因）－ （對照組Ct目的基因－對照組Ct管家基因）。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料結果用表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

化療前B－ALL組miR－21表達水平高于對照組，差異有顯著性（t＝20.75，P＜0.05）；B－ALL高危型組 miR－21表達水平為8.65±0.47，明顯高于標危型組（5.23±0.35），差異有顯著性（t＝23.23，P＜0.05）；化療耐藥組 miR－21表達水平明顯高于化療敏感組，差異有顯著性（t＝10.12，P＜0.05）?；熀驜－ALL組、化療敏感組miR－21表達水平較化療前明顯減低，差異有顯著性（t′＝10.56，t＝13.57，P＜0.05）；化療耐藥組化療前后 miR－21表達水平差異無顯著性（P＞0.05）。見表1。

表1 各組miR－21表達水平比較（）

表1 各組miR－21表達水平比較（）

化療前 化療后對照組 12 2.85±0.98 B－ALL組 36 7.06±0.43 5.24±0.94化療敏感組 30 6.69±0.49 4.59±0.61化療耐藥組組別 n 6 8.92±0.24 8.49±0.67

3 討 論

白血病發(fā)病存在細胞增殖失控、分化障礙及凋亡抑制等生物學特點，造血細胞惡性增殖、凋亡受抑是白血病發(fā)病的主要病理學機制，并決定著白血病病兒的臨床預后［10］？目前普遍認為，miRNA與腫瘤細胞的增殖密切相關，這其中尤以miR－21的研究較多。由于miR－21是目前公認的具有致癌作用的miRNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮樞紐調控效應。已有研究結果表明，miR－21的過度表達與白血病、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和各種非血液系統(tǒng)實體腫瘤增殖、轉移的能力和疾病預后有密切關系［6－8，11－15］；抑癌基因程序性細胞死亡因子4（PDCD4）可能是miR－21的靶基因，過表達的 miR－21能夠抑制PDCD4表達，從而促進腫瘤細胞分化和增殖，并可誘導腫瘤細胞發(fā)生侵襲、血管浸潤和轉移［12－14］。進一步的研究結果顯示，miR－21很可能是腫瘤耐藥的關鍵因素，與腫瘤預后密切相關，反義抑制miR－21能夠增加化療藥物對腫瘤細胞生長抑制［13］。其機制可能與 miR－21靶向作用PTEN，抑制P13K信號通路活化有關［16］。

本文研究結果顯示，B－ALL病兒miR－21表達明顯增高，其中高危型組miR－21表達明顯高于標危型組，化療后miR－21表達較化療前降低，與文獻結果相符，提示miR－21在兒童B－ALL的發(fā)病中發(fā)揮著重要的致癌基因作用。本文研究結果還顯示，B－ALL病兒化療后miR－21表達水平降低，以化療敏感組最為明顯，化療耐藥組miR－21表達化療前后無明顯改變；化療耐藥組化療前miR－21表達顯著高于化療敏感組，提示miR－21過表達可能為兒童B－ALL的不良預后指標，與兒童B－ALL疾病預后有密切關系，miR－21過表達與兒童B－ALL白血病細胞增殖、轉移能力以及疾病預后有密切關系，可作為兒童B－ALL預后判斷指標。但具體的機制有待進一步探討。

綜上所述，miR－21通過對靶基因的調控調節(jié)細胞的分化、增殖和凋亡，其表達增高參與了腫瘤細胞的侵襲、血管浸潤和轉移，miR－21靶向藥物可能成為治療腫瘤的一種行之有效的方法，與抗腫瘤藥物聯(lián)合應用將是腫瘤治療的一個新方向，也是提高療效的關鍵。

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