摘要：目的 研究膜聯蛋白A1（Annexin A1）與血管內皮生長因子C （VEGF-C）在人食管鱗狀細胞癌中蛋白水平的表達差異，分析二者的相互關系及其與食管鱗癌臨床病理因素間的關系，探討二者在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其臨床意義。方法 應用免疫組化檢測68例食管鱗癌及其切緣正常粘膜組織中Annexin A1和VEGF-C的表達，分析二者的表達在兩組間是否有差別及其與食管鱗癌患者臨床病理因素間的關系；并分析食管鱗癌中二者表達的相關性。結果 Annexin A1和VEGF-C在食管鱗癌及其切緣正常粘膜組織中的陽性表達在統(tǒng)計學上有差異（P<0.05）。Annexin A1的表達與患者性別、年齡、臨床分期、組織學分級、淋巴結轉移無顯著相關，VEGF-C的表達與淋巴結轉移顯著相關，與其他臨床病理因素無顯著相關，且二者在食管鱗癌中表達呈顯著負相關（r=-0.524，P<0.05）。結論 Annexin A1基因在食管鱗癌中低表達，在切緣正常粘膜組織中高表達，VEGF-C蛋白表達與Annexin A1蛋白表達之間呈負相關。VEGF-C表達與食管鱗癌淋巴結轉移密切相關。

關鍵詞：食管鱗狀細胞癌；Annexin A1；VEGF-C；免疫組織化學染色

食管癌是全世界10大常見惡性腫瘤之一，預后很差，常浸潤鄰近重要器官結構導致患者死亡。隨著分子生物學技術和基因工程的飛速發(fā)展，基因治療已成為食管癌治療中的一個重要研究領域。許多研究者都在探索食管癌中的基因表達情況及與臨床的關系，從而達到治療食管癌，延長食管癌患者生存期的作用。

膜聯蛋白家族包括約20余種鈣和磷脂結合蛋白，膜聯蛋白A1（annexin A1），是膜聯蛋白超家族成員之一，能抑制磷脂酶A2，介導凋亡。食管癌患者染色體臂9Q上膜聯蛋白I基因附近DNA缺失率很高，這表明膜聯蛋白A1基因功能的喪失在食管癌的發(fā)生中可能起著重要作用。血管內皮生長因子（VEGF）家族編碼5個多肽，血管內皮生長因子-C（VEGF- C）是VEGF家族成員之一，能特異性的激活表達在血管及淋巴管內皮細胞上的受體VEGFR-2和VEGFR-3（又名Flt-4），通過酪氨酸激酶信號系統(tǒng)發(fā)揮生物學效應，從而刺激血管及淋巴管的生成，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著特別重要的作用。

本研究采用免疫組化法檢測食管癌中Annexin A1和VEGF-C的表達，探討二者表達與食管鱗癌患者臨床病理因素間的關系及它們的相關性，為食管癌的診斷和治療提供幫助。

1資料與方法

1.1一般資料 選取中南大學湘雅二醫(yī)院2011年3月～2013年3月初次住院的68例食管鱗癌病例及20例切緣正常粘膜組織。受檢者均行手術治療，術前均未接受其它治療，術后標本均經病檢確診。年齡42～73歲，平均60.4歲，年齡≥55歲者51例，<55歲者17例；男49例，女19例；伴淋巴結轉移者40例；組織學分級按WHO標準：高中分化癌44例，低分化癌24例；TNM臨床分期：I-II期者43例，III-IV期者25例。

1.2方法 所有標本均經福爾馬林固定，石蠟包埋，病理科切取4 μm厚切片，脫蠟去水，采用免疫組織化學SABC法[1]，置于3 %H2O2中15min滅活內源性過氧化物酶。高壓抗原修復充分暴露抗原后自然冷卻，滴加一抗，兔抗人Annexin A1多克隆抗體、鼠抗人VEGF-C多克隆抗體工作濃度均為1：100。4℃冰箱過夜，PBS沖洗，滴加二抗，37 ℃溫箱內孵育30min，PBS沖洗3次；DAB顯色，蒸餾水沖洗、蘇木素襯染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片。PBS 代替一抗作陰性對照， 已知陽性切片作陽性對照。

1.3免疫組化學結果判斷 Annexin A1蛋白陽性表達主要位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色；VEGF-C蛋白陽性表達主要位于胞質，為棕黃色顆粒樣物質。每張切片隨機選取10個高倍視野，計數陽性細胞并計算其陽性率，按陽性細胞占腫瘤細胞的百分率進行判定。將平均陽性率>20 %的歸為陽性， ≤20 %的歸為陰性。

2.1Annexin A1和VEGF-C在不同的食管組織中的表達 Annexin A1和VEGF-C在不同的食管組織中的表達在統(tǒng)計學上有差異（P<0.05），見表1。

2.2 Annexin A1和VEGF-C表達與食管鱗癌臨床病理因素之間的關系 Annexin A1在食管鱗癌中的陽性表達率與患者的年齡、性別、臨床分期、淋巴結轉移及病理組織學分化程度在統(tǒng)計學上均無差異（P>0.05）；VEGF-C在食管鱗癌中的陽性表達率與患者的年齡、性別、病理組織學分化程度及腫瘤浸潤深度在統(tǒng)計學上無差異（P>0.05），但與淋巴結轉移在統(tǒng)計學上有差異（P<0.05），見表2。

3討論

膜聯蛋白已被報道在多個腫瘤中失調[2，3]，這表明膜聯蛋白可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。膜聯蛋白A1的確切功能尚不清楚，它可能參與了細胞分子的很多步驟，如鈣離子的調節(jié)，跨膜轉運，細胞粘附，細胞信號轉導，細胞凋亡，細胞骨架的維持和細胞外基質的完整，發(fā)育和分化，炎癥及血液凝固等，它還是細胞內介導糖皮質激素抗感染作用的一種效應因子，在白細胞遷移及堆積和吞噬中起著重要作用。

不同的腫瘤組織中，Annexin A1的表達水平不同。在很多惡性腫瘤中如乳腺癌、原發(fā)性肝癌、胰腺癌、胃癌、轉移性腎細胞癌和晚期膀胱癌中高表達，而在另一些惡性腫瘤中如前列腺癌、頭頸部腫瘤及食管癌中低表達。本研究發(fā)現Annexin A1陽性表達率在食管鱗癌組織中為38.2%，顯著低于切緣正常粘膜中的陽性表達率80.0%，食管鱗癌中Annexin A1表達下調，這提示Annexin A1表達減少在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

膜聯蛋白A1蛋白的缺失是癌變過程中的早期事件。膜聯蛋白A1在各種細胞系如鱗癌、腺癌等中都發(fā)生了改變，說明它可能在人類腫瘤發(fā)生中起著至關重要的作用。在食管鱗癌患者中膜聯蛋白A1mRNA水平顯著降低，同一個患者體內腫瘤細胞中比癌旁正常組織膜聯蛋白A1表達下調，這說明在不同位置的癌細胞的發(fā)生發(fā)展中有著不同的調節(jié)機制。Annexin A1在食管鱗癌中的陽性表達率與年齡、性別、臨床分期、淋巴結轉移及分化程度在統(tǒng)計學上均無差異（P>0.05），這說明在各種不同臨床病理因素的食管癌患者中Annexin A1都起著很重要的作用?；蛳抡{的原因包括基因缺失、基因突變、啟動子去甲基化等，膜聯蛋白A1在食管癌中表達下調的具體原因尚不清楚，有待進一步研究。

在胃癌[4]，乳腺癌[5]等多種腫瘤中，VEGF-C和VEGFR-3過度表達，且呈顯著負相關。VEGF-C過度表達可以誘導淋巴管的生成，并且促使癌細胞通過淋巴結進行轉移。VEGF-C以旁分泌和自分泌方式分別作用于血管和淋巴管內皮細胞，增加癌細胞的轉移潛力和增殖活性，改變淋巴管內皮的粘附特性， 增加分泌細胞因子和趨化因子， 而在腫瘤組織的血管及淋巴管增殖中起著很大的作用[6]。

據報道，幾乎所有的食管癌組織均表達VEGF-C，82%的食管非典型增生組織表達VEGF-C，而在食管正常粘膜肌層組織中無1例有VEGF-C的表達。食管癌中VEGF-C mRNA的表達明顯高于正常組織[7]。本研究結果顯示，VEGF-C陽性表達率在食管鱗癌組織中為75.0%，顯著高于切緣正常粘膜中的陽性表達率45.0%，提示VEGF-C表達增加在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

VEGF-C的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴管侵犯、淋巴結轉移密切相關，其過表達的腫瘤細胞生長速度明顯高于對照組。本研究發(fā)現VEGF-C在食管鱗癌中的陽性表達率與年齡、性別、分化程度及浸潤深度在統(tǒng)計學上無差異（P>0.05），但與淋巴結轉移在統(tǒng)計學上有差異（P<0.05）。VEGF-C表達是一個獨立的預后因素，癌組織中VEGF-C表達陽性的患者預后明顯差于VEGF-C表達陰性的患者。VEGF-C誘導引起血管通透性增加，這與腫瘤的血行轉移有關。VEGF-C與腫瘤的淋巴管及血管的生成有關，因而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著特別重要的作用[8]。

本研究發(fā)現VEGF-C與Annexin A1的表達呈顯著性負相關，說明在食管鱗癌中Annexin A1可能通過調控VEGF-C的表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但Annexin A1調控VEGF-C的表達的具體機制尚不清楚，部分癌組織中可觀察到膜聯蛋白A1的自身抗體，這提示相應的抗原可應用于臨床，但這尚需繼續(xù)進行研究。

參考文獻：

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[8]Morfoisse F， Kuchnio A， Frainay C， et al. Hypoxia induces VEGF-C expression in metastatic tumor cells via a HIF-1α-independent translation-mediated mechanism[J]. Cell Rep，2014，6（1）：155-167.編輯/申磊