摘要：目的 對β-地中海貧血（β thalassemia，β-TM）患者的進(jìn)行基因分析，了解β-TM患者的基因突變類型。方法 通過全血細(xì)胞分析，篩查出MCV﹤80fL，MCH﹤27pg，Hb﹤110g/L的貧血患者，然后進(jìn)行血紅蛋白電泳分析，通過診斷標(biāo)準(zhǔn)：MCV﹤80fL， HbA2>3.2%，HbF>3.1% 為陽性患者219例，進(jìn)一步應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（reverrsedotblot， RDB），檢測其基因突變類型。結(jié)果 進(jìn)行基因檢測的219例患者中，男性127例，女性92例，進(jìn)行PCR-RDB法的基因診斷共檢出5種突變基因： CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C-T）、TATAbos-28（A-G） 、CD17（A-T）、CD14-15（+G）。其中以CD41-42（-TTCT）突變類型占首位，IVS-Ⅱ-654（C-T）突變類型次之。結(jié)論 PCR-RDB法的基因診斷相對敏感度， 特異性高以及診斷的陽性率高。

關(guān)鍵詞：β-地中海貧血，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，基因突變型

β-地中海貧血（β thalassemia，β-TM）也被稱作β-珠蛋白生成障礙性貧血，是世界上最常見的單基因遺傳性疾病，在我國的南方城市：云南、四川、廣西、貴州等省份多見[1]。它是珠蛋白生成障礙性貧血中發(fā)病率最高的類型，是因?yàn)檫z傳基因缺陷導(dǎo)致血紅蛋白中至少一種珠蛋白合成缺乏或者不足，引起的貧血或者病理狀態(tài)。了解攜帶者的基因突變型對其婚后生育的指導(dǎo)有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 所有的標(biāo)本均來自于2012年4月～2014年4月來我院并且疑為β-TM的患者，均是在全血細(xì)胞分析篩查MCV﹤80fL，MCH﹤27pg，Hb﹤110g/L的貧血患者；進(jìn)行血紅蛋白電泳，篩查符合條件[2]：MCV﹤80fL，MCH﹤27pg，Hb﹤110g/L的219例患者，其中男性患者：127例，女性患者：92例。年齡為1～60歲。標(biāo)本均采集于血常規(guī)的試管中。

1.2方法 PCR-RDB法：主要包括DNA的提取、PCR反應(yīng)和斑點(diǎn)雜交幾個步驟：反應(yīng)體系設(shè)定為：25μL，在PCR中設(shè)置的參數(shù)是：95℃，10min； 94℃，1min；55℃，30sec；72℃，30sec；35個循環(huán)。雜交時將模條與PCR產(chǎn)物（25μL）放入雜交管中，然后加入雜交試劑盒的A液6mL，沸水浴中加熱10min，42℃雜交2h；將膜移至預(yù)熱的B液中，42℃下洗膜15 min，將膜條浸泡在顯色液當(dāng)中，最后避光條件下顯色15min，觀察結(jié)果。

判定結(jié)果主要是依據(jù)如下原則：如果是在突變檢測探針處出現(xiàn)斑點(diǎn)，而在相應(yīng)的野生型探針處并未出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，那么該位點(diǎn)為突變的純合子；如果突變檢測探針處出現(xiàn)顯色的強(qiáng)度和相應(yīng)的野生型探針相近的藍(lán)色斑點(diǎn)，則該位點(diǎn)是野生型和突變型的雜合子；如果僅僅是在野生型探針處出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，那么待檢樣品就沒有上述的17種突變。檢測的17種突變以及DNA探針在膜條上面的排位參見表1。

1.3主要的儀器和試劑 PCR分析儀（7500 Fast real-time，美國羅氏公司）； PCR應(yīng)用亞能公司的試劑盒。

1.4數(shù)據(jù)分析 采用Excel2007軟件對檢出的陽性例數(shù)、構(gòu)成比資料進(jìn)行整理和統(tǒng)計。

2 結(jié)果

β-TM 純合子和雙重雜合子一般呈中間型/重型TM。本研究共檢出β-TM 純合子126例，雙重純合子9例，雜合子63例，雙重雜雜合子20例，PCR-RDB法的基因診斷219例患者中，男性127例，女性92例，共檢出5種突變基因型： CD41-42（-TTCT）、IVS-Ⅱ-654（C-T）、TATAbos-28（A-G） 、CD17（A-T）、CD14-15（+G）。其中以CD41-42（-TTCT）突變類型占首位，為27.85%；IVS-Ⅱ-654（C-T）突變類型次之，為19.63%；重度貧血患者主要是新生兒和兒童，一般青春期前致死。輕微貧血者主要表現(xiàn)為未婚成年患者，另一部分為新生兒，還未表現(xiàn)出嚴(yán)重的貧血，或合并其他類型的TM 有關(guān)。這表明應(yīng)加強(qiáng)本地區(qū)育齡人群β-TM 的篩查，有必要在新生兒、貧血患兒中進(jìn)行β-TM 篩查，做到早診斷、早治療，提高生活質(zhì)量；同時對于成人婚前檢查應(yīng)該加強(qiáng)該項目，對婚后的優(yōu)生優(yōu)育進(jìn)行有力的指導(dǎo)。見表2。

3 討論

地中海貧血（thalassemia，TM），也叫做地貧，是一組遺傳性疾病。它的發(fā)病機(jī)制是合成血紅蛋白的珠蛋白鏈減少或缺失導(dǎo)致血紅蛋白結(jié)構(gòu)異常，這樣的含有異常血紅蛋白的紅細(xì)胞變形性降低，會使紅細(xì)胞提前被肝脾等破壞，致使紅細(xì)胞壽命縮短，導(dǎo)致患者發(fā)生溶血性貧血。一般情況下，TM主要有α、β、γ和δ四種類型。其中的α和β是比較常見的類型。其中的β-TM是人類11號染色體上控制的β珠蛋白鏈合成的基因突變，然后β珠蛋白鏈合成受到抑制，引起β鏈合成減少或缺少造成α、β鏈合成的不平衡。α鏈、β鏈相似的γ鏈或δ鏈代償性增生聚合形成HbF和HbA2，使 HbF和HbA2增加[3]，其它多余游離的α鏈會沉淀在紅細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致紅細(xì)胞變形，紅細(xì)胞脆性降低，壽命縮短，從而發(fā)生溶血性貧血的遺傳性疾病。全血細(xì)胞分析時，表現(xiàn)出：MCV﹤80fL，MCH﹤27pg，Hb﹤110g/L的小細(xì)胞低色素性貧血，中央淺染區(qū)擴(kuò)大，紅細(xì)胞大小不等，出現(xiàn)靶形、異形、嗜多色性紅細(xì)胞、碎片紅細(xì)胞、點(diǎn)彩紅細(xì)胞、有核紅細(xì)胞、豪-焦式小體等等；網(wǎng)織紅細(xì)胞正常或者增高。如果夫妻雙發(fā)為同型地中海貧血，由于該疾病為常染色體上的隱形遺傳，那么該子女有1/4的機(jī)會患重型地中海貧血，這樣的情況下，患者一般在青春期前死亡。將經(jīng)過全血細(xì)胞分析篩查出的患者進(jìn)行血紅蛋白電泳。血紅蛋白電泳是通過和正常人的血紅蛋白電泳圖譜進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白區(qū)帶。比如HbE、HbBarts、HbS、HbD、HbH、 HbF、HbA2和HbC，在珠蛋白生成障礙性貧血的血紅蛋白電泳中，可以通過蛋白的含量來進(jìn)行分類，診斷β-TM的標(biāo)準(zhǔn)：MCV﹤80fL， HbA2>3.2%，HbF>3.1%。此方法簡便易行、快速可靠，電泳分析是血紅蛋白電泳分離和鑒定最為常用和最為有效的方法[4]。將通過篩查標(biāo)準(zhǔn)的219例患者進(jìn)行PCR-RDB基因診斷。

PCR-RDB是一種斑點(diǎn)雜交技術(shù)，優(yōu)點(diǎn)是在一次的雜交反應(yīng)中，可以同時檢測樣品中的幾種核酸。PCR-RDB是基因診斷，也是分子診斷，是通過受檢者的某一特定基因（DNA）或者是轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物（mRNA）進(jìn)行分析來對遺傳病進(jìn)行診斷技術(shù)。該方法快速，簡便，高敏感性和特異性強(qiáng)。在基因分型、基因突變檢測方面具有獨(dú)特和有利的優(yōu)勢[5]?；驒z測，進(jìn)一步完善提高了實(shí)驗(yàn)室對β-TM檢測手段的準(zhǔn)確性和靈敏度。，在世界范圍已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了170多種β-TM基因突變，其中20多種為大片段缺失型，其他的都是點(diǎn)突變和少數(shù)的堿基缺失或者插入[6]。在我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)27種基因突變型[7]。在本研究中17種突變位點(diǎn)檢出了5種突變基因： CD41-42（-TTCT）、CD17（A-T）、IVS-Ⅱ-654（C-T）、TATAbos-28（A-G）、CD14-15（+G）。在純合子中以CD41-42（-TTCT）突變類型占首位，構(gòu)成比27.85%；IVS-Ⅱ-654（C-T）突變類型次之，構(gòu)成比19.63%。

綜上所述：在β-TM患者是社會和家庭的重大負(fù)擔(dān)，診斷中充分應(yīng)用PCR-RDB法是目前診斷患者和杜絕重型地中海貧血患兒出生行之有效的試驗(yàn)方法。加強(qiáng)該項目婚前檢查的力度以及大力宣傳相關(guān)知識是一個重要而艱巨的任務(wù)。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/哈濤