摘要：目的 規(guī)范微生物檢查方法驗(yàn)證工作，便于人們進(jìn)行微生物限度和無(wú)菌檢查工作時(shí)參考。方法 微生物檢查法方法驗(yàn)證工作錯(cuò)綜復(fù)雜， 影響因素較多，如培養(yǎng)基、試驗(yàn)步驟以及供試品的制備等。在方法驗(yàn)證過(guò)程中， 探討上述因素對(duì)驗(yàn)證結(jié)果的影響。結(jié)果 本文系統(tǒng)闡述了微生物限度和無(wú)菌檢查法驗(yàn)證的內(nèi)容和技術(shù)評(píng)價(jià)要求，對(duì)準(zhǔn)確檢測(cè)藥品中微生物含量等指標(biāo)有著非常重要的參考價(jià)值和指導(dǎo)意義。結(jié)論 微生物檢查法方法驗(yàn)證工作較為復(fù)雜，闡述了多種供試品的制備途徑。

關(guān)鍵詞：微生物限度；無(wú)菌檢查；方法驗(yàn)證；影響因素；微生物檢測(cè)

微生物學(xué)檢查方法包括微生物限度檢查法和無(wú)菌檢查法。微生物限度檢查法是檢查非規(guī)定滅菌制劑及原輔料受微生物污染程度，包括細(xì)菌、霉菌等菌種的數(shù)目及控制菌檢查。無(wú)菌檢查法是檢查藥典要求的無(wú)菌藥品、原輔料等是否無(wú)菌。如外用制劑須檢查和驗(yàn)證銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌；若制劑含藥材原粉等， 還需檢查和驗(yàn)證大腸菌群和（或） 沙門菌。通過(guò)不同給藥途徑，因此臨床給藥途徑在微生物限度檢查和方法驗(yàn)證中有著舉足輕重的地位。

1 方法驗(yàn)證的模式及影響因素

1.1 培養(yǎng)基的無(wú)菌檢查及菌株準(zhǔn)備 使用時(shí)應(yīng)仔細(xì)觀察培養(yǎng)基碟子， 檢查是否有微生物污染或干燥收縮。經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照相應(yīng)測(cè)定的微生物， 選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株（不超過(guò)5代） 試驗(yàn)?？刂凭€應(yīng)設(shè)定對(duì)照組， 以檢測(cè)其專屬性。

1.2 微生物方法驗(yàn)證的內(nèi)容

1.2.1 細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證內(nèi)容 至少進(jìn)行3次平行試驗(yàn)， 分別計(jì)算每次各試驗(yàn)菌的回收率。驗(yàn)證菌株為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、枯草桿菌。驗(yàn)證方法分試驗(yàn)組、菌液組、稀釋劑對(duì)照組以及供試品對(duì)照組，方法如下：試驗(yàn)組：采用平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，每株試驗(yàn)菌均制備2個(gè)平皿；也可采用薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)。菌液組：應(yīng)檢測(cè)添加的試驗(yàn)菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組：檢查供試液制備時(shí)，微生物受污染程度，采用薄膜過(guò)濾法計(jì)算其菌數(shù)。供試品對(duì)照組：定量取供試液，采用薄膜過(guò)濾法計(jì)算其供試品本底菌數(shù)。無(wú)菌檢查可采用：①薄膜過(guò)濾法：采用微孔濾膜攔截細(xì)菌，去除可溶性成分。驗(yàn)證重點(diǎn)：確定濾膜的適用性、沖洗方法以及沖洗液用量。②中和法：中和劑應(yīng)對(duì)微生物無(wú)毒性，與抑菌性成分結(jié)合后的產(chǎn)物，也應(yīng)對(duì)微生物無(wú)毒性。驗(yàn)證重點(diǎn)：確定中和劑有效，并證明對(duì)污染微生物無(wú)毒性。

1.2.2 控制菌檢查法的驗(yàn)證內(nèi)容 控制菌檢查包括大腸菌群、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、銅綠假單胞菌和梭菌檢查。試驗(yàn)菌株嚴(yán)格按照規(guī)定檢查的控制菌，選取相應(yīng)的驗(yàn)證菌株。方法如下：試驗(yàn)組：按照相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，添加試驗(yàn)菌應(yīng)選在最后一次沖洗液后， 過(guò)濾后方可注入培養(yǎng)基中。對(duì)照組：驗(yàn)證該檢查方法的專屬性。

1.2.3 細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證結(jié)果判斷指標(biāo) 根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，可計(jì)算供試品組的菌回收率、稀釋劑對(duì)照組的菌回收率。如果任意一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率，低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過(guò)濾法等方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。

1.2.4 控制菌方法驗(yàn)證的結(jié)果判斷 按《中國(guó)藥典》2005年版規(guī)定，陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。如果試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，則按照相應(yīng)方法進(jìn)行控制菌檢查。如果試驗(yàn)組未檢出，則需重新驗(yàn)證?？刂凭鷻z查還應(yīng)設(shè)有專屬性試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)及結(jié)果的判斷：①目標(biāo)菌陽(yáng)性對(duì)照管菌和供試品加目標(biāo)菌管生長(zhǎng)良好；②陰性對(duì)照管以及陰性菌對(duì)照必須無(wú)菌生長(zhǎng)。如果上述試驗(yàn)成立，表示可按照該方法進(jìn)行該品種的控制菌檢查。

1.3 特殊供試品的制備 由于供試品本身的特性，可能會(huì)產(chǎn)生假陰性。在正常生產(chǎn)過(guò)程中，利用供試品與微生物的差異，消除供試品對(duì)藥品中微生物的影響，從而準(zhǔn)確檢測(cè)藥品中微生物的真實(shí)含量，是較為普遍使用的方法。具體包括：①培養(yǎng)基稀釋法：取規(guī)定量供試品/供試液，加至培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品濃度稀釋至無(wú)明顯抑菌作用。適用范圍：不能使用薄膜過(guò)濾法，抑菌活性較弱的樣品。驗(yàn)證重點(diǎn)：把握好培養(yǎng)基增加量與供試品/供試液不顯抑菌活性的關(guān)系。②離心沉淀法：利用沉降系數(shù)差異除去藥渣以及含抑菌活性的部分。適用范圍：不能采用薄膜過(guò)濾等方法的樣品。驗(yàn)證重點(diǎn)：設(shè)置有效離心率，確定能將藥渣、抑菌部分除去。③薄膜過(guò)濾法：采用微孔濾膜攔截細(xì)菌，去除可溶性成分。④中和法：中和劑應(yīng)對(duì)微生物無(wú)毒性，與抑菌性成分結(jié)合后的產(chǎn)物，也應(yīng)對(duì)微生物無(wú)毒性。

2 微生物檢查方法驗(yàn)證的難點(diǎn)問(wèn)題

人們對(duì)藥品生產(chǎn)、保存和使用過(guò)程中，對(duì)于可能出現(xiàn)的微生物污染問(wèn)題進(jìn)行了大量的研究考察。很多研究資料表明[1，2]：藥品中污染的微生物數(shù)量以及微生物種類有不確定性，在藥品生產(chǎn)環(huán)節(jié)中， 微生物污染存在著隨機(jī)性。因此，為了監(jiān)控藥品生產(chǎn)過(guò)程中的微生物污染。所有的藥品必須在安全性檢查后，才能應(yīng)用于臨床。無(wú)論是無(wú)抑菌性藥物還是抑菌性藥物，都要進(jìn)行微生物限度檢查， 特別是某些微生物在一定環(huán)境下可能受到損傷， 但當(dāng)服用至人體后， 條件適宜時(shí)仍可生長(zhǎng)繁殖，破壞人體健康。抑菌藥物內(nèi)微生物能夠?qū)θ梭w健康造成危害的情況必須警惕， 因此必須對(duì)抑菌性藥物進(jìn)行微生物限度檢查，但由于其本身的抑菌作用， 這嚴(yán)重影響了微生物的檢出。

3討論

藥品微生物限度檢查方法驗(yàn)證工作是錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程，控制不當(dāng)很難達(dá)到驗(yàn)證要求以及預(yù)想的試驗(yàn)效果。嚴(yán)格按照操作規(guī)范操作， 盡量避免試驗(yàn)過(guò)程中的誤差。

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編輯/王海靜