摘要：目的 評(píng)價(jià)熏煙和氣道內(nèi)滴入脂多糖（LPS）建立大鼠慢性阻塞性肺疾?。–OPD）模型的可行性。方法 40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和COPD模型組，模型組熏煙和氣道內(nèi)滴入LPS16w。測(cè)定氣道阻力，計(jì)數(shù)大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞總數(shù)，肺組織病理切片行HE和AB-PAS染色，并測(cè)定肺組織粘蛋白（MUC5AC）含量。結(jié)果 模型組大鼠氣道阻力增加（RL%）較對(duì)照組有顯著性差異，BALF中白細(xì)胞總數(shù)明顯高于對(duì)照組，光鏡下可見(jiàn)病變呈慢性支氣管炎，肺組織MUC5AC含量明顯高于對(duì)照組。結(jié)論 熏煙和氣道內(nèi)滴入LPS能建立較符合人類(lèi)COPD病變的大鼠模型，為進(jìn)一步的研究提供參照資料。

關(guān)鍵詞：肺疾??；慢性阻塞；脂多糖；吸煙；大鼠

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見(jiàn)的呼吸道疾病，目前發(fā)病率和病死率都較高，社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，影響了該病藥物的研發(fā)。鑒于吸煙和反復(fù)不斷的氣道感染是COPD發(fā)生發(fā)展的主要原因，我們采用熏煙和氣道內(nèi)滴入LPS的方法建立COPD的大鼠模型，為進(jìn)一步研究人類(lèi)COPD提供參照資料。

1資料與方法

1.1試劑與動(dòng)物 脂多糖（LPS，EsherichiacoliO111：B4，美國(guó)Sigma公司）；乙酰甲膽堿（Mch，美國(guó)Sigma公司）；MUC5AC（粘蛋白）ELISA試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技有限公司）。健康雄性SD大鼠，體重（200±20）g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2造模方法 SD大鼠40只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和COPD模型組。將模型組大鼠分批置于自制有機(jī)玻璃密閉熏煙箱（85 cm×85 cm×45 cm）內(nèi)，每天（一周6d，滴LPS當(dāng)天除外）共煙熏40 min，分2次進(jìn)行，1次給予12支Marlboro香煙，持續(xù)20min，間隔10min再熏煙1次，每批總共給予24支香煙。氣道內(nèi)滴入LPS的時(shí)間為每隔2w 1次，除對(duì)照組外，其余大鼠氣管內(nèi)用靜脈套管針滴入200μg脂多糖（用生理鹽水配制成1 g·L-1溶液），對(duì)照組氣道內(nèi)滴入等量生理鹽水（NS），每隔2w 1次至第16w結(jié)束。

1.3大鼠氣道阻力（RL）測(cè)定[1] 第16w后用30%烏拉坦（3.3 ml·kg-1，ip）麻醉大鼠，用Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄儀，導(dǎo)出基礎(chǔ)潮氣量（VT）和氣道流速（V），計(jì)算RL。配制濃度為0.125、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg·mL-1的Mch，分別置于霧化吸入機(jī)中，測(cè)出不同濃度Mch誘導(dǎo)下的大鼠潮氣量和氣道流速，通過(guò)RL的變化得出氣道阻力的增加值（RL%）。

1.4支氣管肺泡灌 洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù)：股動(dòng)脈放血處死大鼠，用8 ml生理鹽水進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，灌洗分2次進(jìn)行。回收支氣管肺泡灌洗液（BALF）。BALF 4℃，1000 r·min-1離心10 min，取上清液-80 ℃保存，沉淀用NS 0.5 mL混勻，取細(xì)胞混懸液100 μL用白細(xì)胞計(jì)數(shù)液100 μL稀釋?zhuān)?jì)數(shù)BALF中白細(xì)胞總數(shù)。

1.5病理學(xué)檢查 病理組織切片，常規(guī)HE染色觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，阿爾辛藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫染色（AB-PAS）觀察氣道杯狀細(xì)胞及黏液分泌，測(cè)定如下指標(biāo)。

1.5.1肺組織炎癥程度 HE染色切片中，根據(jù)炎癥及上皮脫落程度將炎癥分為\"+，++，+++三個(gè)等級(jí)。\"+\"為未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；\"++\"為少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；\"+++\"為可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可出現(xiàn)管壁破壞及（或）上皮脫落。

1.5.2杯狀細(xì)胞比值 每張AB-PAS染色切片中，計(jì)算1支支氣管和3～5支細(xì)支氣管陽(yáng)性杯狀細(xì)胞數(shù)和柱狀上皮細(xì)胞的總數(shù)，得出陽(yáng)性杯狀細(xì)胞數(shù)/柱狀上皮細(xì)胞總數(shù)的比值，即杯狀細(xì)胞陽(yáng)性百分率，求平均值。

1.6肺組織MUC5AC含量測(cè)定 用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 for windows進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用兩組間均數(shù)t檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用RADIT分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠氣道阻力（RL） 在Mch 0.5，1.0，2.0，8.0，16.0 mg·mL-1濃度刺激下，模型組氣道阻力增加（RL%）較對(duì)照組有顯著性差異（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 BALF中白細(xì)胞總數(shù) 模型組BALF中白細(xì)胞總數(shù)為（105.15±41.59）×107/L，對(duì)照組為（36.75±12.83）×107/L，可見(jiàn)模型組較對(duì)照組明顯增多（P<0.001）。

2.3兩組大鼠肺組織炎癥 光鏡下對(duì)照組肺組織無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)肺泡擴(kuò)張。模型組大鼠支氣管上皮明顯脫落，肺部炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，有明顯支氣管炎及肺間質(zhì)炎，見(jiàn)表1，圖2。

2.4 支氣管杯狀細(xì)胞增生及肺組織MUC5AC含量：模型組支氣管及細(xì)支氣管杯狀細(xì)胞較對(duì)照組明顯增生；杯狀細(xì)胞陽(yáng)性%明顯增高；肺組織MUC5AC含量也明顯增高，見(jiàn)表2，圖3。

3討論

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以氣道炎癥和肺實(shí)質(zhì)的破壞或肺氣腫為主要特征的慢性小氣道病變，其特征是持續(xù)存在的氣流受限，氣流受限常呈進(jìn)行性加重，與肺部對(duì)有害顆?；驓怏w的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。其主要病因?yàn)槲鼰熀头磸?fù)不斷的氣道感染。煙草中的有害物質(zhì)會(huì)引起肺部炎癥和肺組織的破壞，并損害肺正常的防御和修復(fù)功能。肺組織的損害包括粘液高分泌、氣道狹窄、肺纖維化及肺氣腫等，這些病理學(xué)改變反過(guò)來(lái)又可導(dǎo)致氣流受限和其他病理學(xué)改變[2]。LPS是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成分，作為內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體產(chǎn)生致病作用。它可刺激單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及上皮細(xì)胞等合成并釋放一系列前炎癥因子和炎癥因子，如：腫瘤壞死因子a（TNF-a）、白細(xì)胞介素8（IL-8）等，介導(dǎo)氣道和肺組織的炎癥反應(yīng)[3]。本實(shí)驗(yàn)我們采用熏煙和氣道內(nèi)滴入脂多糖法建立COPD的大鼠模型，觀察其是否符合人類(lèi)COPD病變。

氣道黏液高分泌是COPD的重要病理生理特征。在多種刺激因素如吸煙、LPS的作用下，杯狀細(xì)胞發(fā)生增生分化，并分泌黏蛋白MUC5AC。MUC5AC作為氣道黏液中的主要成分，對(duì)氣道黏液的彈性和黏附特性起重要作用，但黏液的過(guò)度分泌使氣道炎癥進(jìn)一步發(fā)展，并損害患者的肺功能[4，5]。

本實(shí)驗(yàn)顯示COPD模型組MUC5AC含量明顯增高，氣道上皮杯狀細(xì)胞增生，提示發(fā)生氣道重構(gòu)。模型組氣道阻力增加，表明存在氣流阻塞，肺功能有所改變。模型組還出現(xiàn)了COPD典型的病理學(xué)改變，如炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。本模型符合人類(lèi)COPD病變，可用于COPD進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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編輯/申磊