摘要：目的 比較頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測(cè)耐甲氧西林金葡菌（ MRSA） 的可靠性。方法 分別采用頭孢西丁與苯唑西林紙片擴(kuò)散法檢測(cè)臨床分離的132種金黃色葡萄菌株，采用mecA 基因方法為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種方法的準(zhǔn)確性。結(jié)果 頭孢西丁紙片擴(kuò)散法與mecA基因檢測(cè)高度一致為100%，苯唑西林檢測(cè)的敏感性和特異性分別明顯低于頭孢西丁。結(jié)論 頭孢西丁紙片擴(kuò)散法是篩選和確認(rèn)MRSA 的一種可靠的試驗(yàn)方法。

關(guān)鍵詞：耐甲氧西林金葡菌；頭孢西??；紙片擴(kuò)散法

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ meticillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA） 是醫(yī)院感染和社區(qū)感染的主要病原菌， 其有效的治療和預(yù)防有賴于快速準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)診斷，本研究以mecA基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，對(duì)頭孢西丁和苯唑西林紙片擴(kuò)散法檢測(cè)MRSA的結(jié)果進(jìn)行了比較。

1資料與方法

1.1一般資料 129株臨床分離金黃色葡萄球菌株，耐甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌ATCC25923，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC25923，30 μg頭孢西丁藥敏紙片、1 μg苯唑西林藥敏紙片、M-H瓊脂，mecA基因擴(kuò)增引物：引物序列上游F：5-' AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3'引物序列下游R：5-' AGTTCTGCAGTACCGGATTT GC-3'。

1.2方法

1.2.1紙片擴(kuò)散法 將臨床分離得到的金黃色葡萄球菌取經(jīng)35℃孵育18～24 h的單個(gè)菌落，用無菌生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，分別涂布含有4% NaCl 的M-H 瓊脂表面上，將苯唑西林和頭孢西丁藥敏紙片放在瓊脂表面，35℃孵育24 h 后閱讀結(jié)果，執(zhí)行NCCLS 2004[1]最新的標(biāo)準(zhǔn)：頭孢西丁紙片擴(kuò)散法抑菌圈直徑≤19 mm為耐藥、≥20 mm為敏感；苯唑西林紙片擴(kuò)散法抑菌圈直徑≤10 mm為耐藥、11～12 mm為中介、≥13 mm為敏感。

1.2.2 PCR反應(yīng)檢測(cè)mecA基因 ①制備DNA模板 挑取平板上的的單個(gè)菌落，混懸于0.5 mL pH 8.0的T E中煮沸10 min，以7 000 r/min 的速度離心10 min后取上清液。②PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為50 μL其中引物1 μL，PCR 緩沖液5 μL，dNTP（200 μmol/μL） 1 μL，Mg2+0.5 mmol/L，Taq酶2.5 U，DNA 模板2 μL，雙蒸水35.5 μL。擴(kuò)增條件為94℃初變性4 min，然后94℃變性30 s，退火溫度為52℃，時(shí)間為30 s，72℃延伸45 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)最后延伸10 min，PCR 產(chǎn)物在0.7% 的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果[2]。

2結(jié)果

129株金黃色葡萄球菌中，mecA基因陽性有85株，陰性有47株。以mecA 基因檢測(cè)為標(biāo)準(zhǔn)方法，頭孢西丁紙片擴(kuò)散法的敏感性和特異性為100%和100%，苯唑西林紙片擴(kuò)散法的敏感性和特異性為98.4%和95.7%。頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測(cè)MRSA 的敏感性和特異性明顯高于苯唑西林紙片擴(kuò)散法。

3討論

MRSA產(chǎn)生的一個(gè)原因是金黃色葡萄球菌獲得了mecA基因，能夠編碼產(chǎn)生低親和力的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a[3]mecA或PBP2a因此被認(rèn)為是檢測(cè)MRSA的金標(biāo)準(zhǔn)。

2004年NCCLS增加了一種檢測(cè)和確認(rèn)MRSA的新方法即頭孢西丁紙片擴(kuò)散法，根據(jù)這一標(biāo)準(zhǔn)，我們對(duì)臨床分離的132株金黃色葡萄球菌進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，有3株mecA陽性的菌株，對(duì)苯唑西林表現(xiàn)為敏感，證明苯唑西林紙片法較難檢側(cè)出耐藥表現(xiàn)不均一的菌株，而使用30 μg頭抱西丁紙片法檢測(cè)甲氧西林金黃色葡萄球菌，其特異性和敏感性均達(dá)到100%，且敏感株抑菌圈直徑較大，易于判斷，研究推側(cè)可能是頭孢西丁比苯唑西林能更好誘導(dǎo)mecA 基因的表達(dá)。

頭孢西丁紙片擴(kuò)散法操作簡便，敏感性和特異性高，結(jié)果與mecA 基因檢測(cè)一致，可作為臨床確證MRSA的可靠方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].Fourteenth inform ational supplement. NCCLS documentM100- S14.Wayne，Pennsylvania：NCCLS，2004.1-159.

[2]Louie L， Goodfellow J， Mathieu P， et al. Rapid detection of methicillin-resistant Staphy lococci from blood culture bottles by using a multiplex PCR assay[J].Clin Microbiol，2002，40：2786-2790.

[3]Annie F， Bernadette G， Philippe HL， et al. Evaluation of three techniques for detection of low-level methicillin-resistant Staphy lococcus aureus （MRSA）：a diffusion method with cefox itin and moxalactam，the Vitek2 system，and the MRSA-screen latex agglutinat iontest[J].J Clin Microbiol，2002，40：2766-2771.編輯/肖慧