摘要：過繼免疫治療是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容，在細(xì)胞免疫中，A-NK細(xì)胞作為腫瘤過繼免疫治療（AIT）中的一種新型免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有短期內(nèi)大量增殖，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力，抗菌，抗病毒，抗衰老，抗腫瘤的特點(diǎn)受到普遍關(guān)注，臨床應(yīng)用也顯示出廣闊前景。本文追蹤國際上研究進(jìn)展就有關(guān)A-NK細(xì)胞生物學(xué)特性，免疫調(diào)節(jié)及臨床應(yīng)用的研究現(xiàn)況及進(jìn)展作以簡要綜述。

關(guān)鍵詞：過繼免疫治療；A-NK；臨床應(yīng)用

中圖分類號(hào)：R473.73 文獻(xiàn)標(biāo)示碼：A

近年來，隨著人類疾病治療學(xué)的進(jìn)展，過繼免疫治療（AIT）成為免疫生物治療中的主要療法之一。從80年代后期，LAK、TIL、NK、CTL、DC、CIK等效應(yīng)細(xì)胞陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用報(bào)道層出不窮。1988年美國Pittsburgh大學(xué)首次從LAK細(xì)胞群體中分離純化了一種具有高效殺傷活性的LAK亞群，由于它具有粘附在塑料表面的特征將其命名為A-LAK（ad herent LAK）。之后， 隨著A-LAK研究的深入和進(jìn)展，我們發(fā)現(xiàn)其與LAK之間有著諸多不同之處， 而與NK細(xì)胞具有相同的表面標(biāo)志，相似的生物學(xué)活性，本課題組近年多以A-NK（activated NKcells）代替A-LAK這個(gè)名稱。

1 A-NK的生物學(xué)特征

A-NK可來源于人外周寫單個(gè)核細(xì)胞（PBMNC）、骨髓、淋巴結(jié)、脾細(xì)胞、臍帶血等，其中后兩者是最好的A-NK來源。美國Pittsburgh大學(xué)Vujanovic課題組最初分離制備A-NK時(shí)提出，A-NK可能來源于大淋巴細(xì)胞，因?yàn)樵谛螒B(tài)、表型特征和生物學(xué)活性方面，二者具有同源性[1]。1990年Melder通過A-NK形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)研究指出，初次分離的A-NK在粘附相及非粘附相之間周期性波動(dòng)。動(dòng)態(tài)觀察有無IL-2條件下常規(guī)NK的粘附狀態(tài)表明，只有相當(dāng)少的一部分NK（1%～10%）具有自發(fā)粘附到塑料表面的特性，但在6000IU/mlIL-2存在時(shí)，一部分（4%～30%）NK也可以迅速轉(zhuǎn)化為粘附NK，24h后這部分細(xì)胞又失去粘附活性。因此，IL-2誘導(dǎo)NK粘附作用只是非常迅速的一個(gè)過程。A-NK的超微結(jié)構(gòu)與高度活化的NK一致，所有的A-NK均為球形，表面有眾多絨毛和偽足。在粘附相，A-NK也是可動(dòng)的，一般可沿著固體表面移動(dòng)1μm/min，1個(gè)極性末端是有皺而毛糙的邊角結(jié)構(gòu)，另一端絨毛呈線圈樣。用透射電鏡也證實(shí)A-NK結(jié)構(gòu)高度極化，一端為細(xì)胞核，另一端為細(xì)胞漿，顆粒豐富，骨架結(jié)構(gòu)較大，具有多囊泡小體和活躍的Golgi小體[2]。此后研究進(jìn)一步明確，A-NK來源于成熟靜息狀態(tài)的NK亞群，占全部單個(gè)核細(xì)胞的1%～4%，占總NK的15%～50%，與未成熟NK或活化的終末NK細(xì)胞不同。A-NK代表了表型和功能獨(dú)特的NK亞群。用流式細(xì)胞儀（FACS）進(jìn)行A-NK表面標(biāo)志分析顯示，A-NK表達(dá)CD56dim -CD16dim -β2 intergrinsbrightIL-2Rp75+表型，A-NK和NK一樣，其表面有多種復(fù)雜的粘附分子（CAM）存在，并與其生物學(xué)活性息息相關(guān)。為了評(píng)價(jià)CAM在A-NK粘附特性中起的作用大小，Melder發(fā)現(xiàn)CD11c，CD11a，CD18分子在活化的NK與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用中起關(guān)鍵作用，與A-NK粘附于腫瘤血管而短暫停留于正常組織的現(xiàn)象有關(guān)。也有學(xué)者證實(shí)CD18相關(guān)的層粘連素CD11a，CD11b，CD11c，CD2在A-NK與靶細(xì)胞的相互識(shí)別中起重要作用。Gunji Y指出A-NK是大顆粒淋巴細(xì)胞，表達(dá)NK細(xì)胞表型膜標(biāo)志（asialo GM1+， NK1.1+， Qa5+， Ly-6.2+， Thy-1.2+，但Lyt-2.2 and L3T4陰性），具有相對(duì)較高的細(xì)胞毒性[3]。圖1為本課題組提取活化的A-NK免疫效應(yīng)細(xì)胞，它通過突觸粘附至癌細(xì)胞（掃描電鏡）。圖2顯示A-NK細(xì)胞聚集，粘附至癌細(xì)胞周圍，形成花環(huán)狀，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)空泡變性，細(xì)胞膜損傷、溶解等壞死征象（透射電鏡）。

2 A-NK的腫瘤治療研究

2.1 A-NK體外增殖能力和抗腫瘤能力 A-NK優(yōu)點(diǎn)主要有2點(diǎn)：①是抗腫瘤能力強(qiáng)；②是體外擴(kuò)增能力強(qiáng)。在自體條件培養(yǎng)基（AuCM）存在條件下，A-NK可于20d內(nèi)擴(kuò)增130～1100倍，臨床級(jí)A-NK擴(kuò)增倍數(shù)稍低，但也可于8～14d內(nèi)擴(kuò)增10～22倍。以22nmol/mlIL-2誘導(dǎo)下是否能迅速粘附到實(shí)體表面的能力，NK被分為兩種不同亞群，A-NK和NA-NK[2]。分別培養(yǎng)二者作動(dòng)態(tài)比較，A-NK增殖能力始終強(qiáng)于NA-NK，但誘導(dǎo)力遲于NA-NK。在抗瘤能力方面，A-NK結(jié)合并殺傷K562和Daudi細(xì)胞的能力明顯高于NA-NK，并能侵潤到腫瘤細(xì)胞囊球內(nèi)部殺傷腫瘤細(xì)胞。大量體外實(shí)驗(yàn)表明，A-NK抗NK敏感性K562，NK抵抗性Daudi、Raji及新鮮腎細(xì)胞癌、子宮頸癌、卵巢癌的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于常規(guī)LAK。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明，A-NK和IL-2過繼輸注幾乎能完全抑制在裸鼠體內(nèi)建立的人頭頸部鱗癌模型腫瘤的生長，對(duì)胃癌肝轉(zhuǎn)移模型能明顯減少肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目并延長小鼠生存期[3]。A-NK/IL-2療法對(duì)實(shí)體瘤的治療結(jié)果很大程度上取決于A-NK在腫瘤部位的聚集能力。這種選擇性聚集能力至少受五種因素影響：①腫瘤血管的構(gòu)造和超微結(jié)構(gòu)；②A-NK的不規(guī)則外形；③IL-2激活的A-NK剛性增強(qiáng)；④A-NK表面高度表達(dá)的CAM與機(jī)體血管及腫瘤微循環(huán)的相互作用；⑤腫瘤組織可能分泌一些趨化性介質(zhì)，如TGFβ，IL 6等，吸引和促進(jìn)A-NK聚集和粘附。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)靜脈注射的A-NK很快就在肺臟和肺部轉(zhuǎn)移灶聚集和停滯，只有相當(dāng)少的一部分A-NK隨后進(jìn)入循環(huán)。到達(dá)肺部轉(zhuǎn)移灶的A-NK一部分來源于血液，另一部分從周圍的肺組織移行過來。而到達(dá)腫瘤特定部位的A-NK細(xì)胞數(shù)量多少是關(guān)系到療效好壞的關(guān)鍵步驟。自從1991年日本Basse P提出局部輸入A-NK可以更好地使其聚集在已建立的荷瘤鼠模型的肝癌或肺癌部位之后，A-NK的研究者們意識(shí)到其體內(nèi)存活及分布情況與輸入途徑及IL-2劑量密切相關(guān)。Sacchi使用腫瘤局部注射A-NK和IL-2在建立的人頭頸部鱗癌鼠模型中獲得了良好療效，并顯著減少了全身治療的副作用。1998年Heganaars使用熒光標(biāo)記A-NK，在小鼠肝癌模型上比較了三種輸注途徑（通過肝動(dòng)脈、門靜脈和頸靜脈給藥）A-NK的選擇性聚集情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝動(dòng)脈途徑A-NK在腫瘤部位聚集最多，其次是門靜脈，而頸靜脈途徑最少。這說明局部注射A-NK比靜脈給藥的全身治療具有更確切的效果和更大的潛力，A-NK的局部應(yīng)用成為研究者們關(guān)注和提倡的給藥途徑[4-8]。

2.2 A-NK抗腫瘤作用機(jī)制 A-NK作用機(jī)制還沒有明確結(jié)論，可能存在多種機(jī)制：①與NK相似的穿孔素和顆粒酶介導(dǎo)的腫瘤溶解作用；②直接接觸腫瘤細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。Felgar1992年提出，A-NK存在一種漿膜相關(guān)溶解因子（M-CTX），通過使DNA斷裂和胞膜大面積腫脹使靶細(xì)胞致死；③A-NK可以分泌多種細(xì)胞因子，如IL-2，IL-4，IL-10，IFNγ，TNFα等，可以破壞腫瘤微循環(huán)，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，也有人認(rèn)為細(xì)胞因子介導(dǎo)腫瘤DNA斷裂，引起腫瘤細(xì)胞緩慢凋亡。BlomWM觀察到在殺傷過程中，靶細(xì)胞出現(xiàn)線粒體膜電位下降，大皰結(jié)構(gòu)形成，磷脂酰絲氨酸外表達(dá)，染色質(zhì)聚集和核碎裂的現(xiàn)象，一旦凋亡被阻止，只表現(xiàn)出相當(dāng)有限的靶細(xì)胞壞死效應(yīng)；④在A-NK和細(xì)胞因子刺激下，內(nèi)源性其它的效應(yīng)細(xì)胞（主要是中性粒和T細(xì)胞）和細(xì)胞毒分子滲出，引起腫瘤出血壞死[9]。德克薩斯大學(xué)研究表明CD16+， CD56+， CD3- NK 發(fā)揮最大的細(xì)胞毒功能，CD5+ 細(xì)胞亞群也參與其中[7]，A- NK也 提供了一種新的白血病治療手段。

德國Koberda J表明， A-LAK 的一個(gè)特征是IL-2和該細(xì)胞表面p55 IL-2受體結(jié)合導(dǎo)致內(nèi)源性細(xì)胞因子的釋放，如IFNr，TNFa，IL-6，由此使之具有最好的細(xì)胞毒性[10]。Sasaki A，觀察到注入的A-NK細(xì)胞在1～2d內(nèi)可進(jìn)入腫瘤的微血管，隨后彌散到腫瘤周圍引起腫瘤細(xì)胞壞死的發(fā)生，提示過繼免疫療法直接的細(xì)胞毒性是經(jīng)由腫瘤血管介導(dǎo)的，這一點(diǎn)作為腫瘤治療的一個(gè)機(jī)制必須加以重視[11]。另有意大利研究者Ruffini PA在一個(gè)類似試驗(yàn)中證實(shí)粘附的要比非粘附的A-NK作用明顯，但同時(shí)指出轉(zhuǎn)化因子中和抗體（TGF ）可以影響局部細(xì)胞免疫治療的有效性[12]。Felgar RE報(bào)告該課題組從高度純化的A-NK細(xì)胞漿膜中發(fā)現(xiàn)并純化了一個(gè)新的細(xì)胞溶解因子plasma membrane-associated cytolytic factor （designate命名為 M-CTX），這種因子是以前未曾描述過的膜相關(guān)毒素，可能參與接觸介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷[13]。

可以看出，A-NK的殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制涉及細(xì)胞之間，細(xì)胞因子之間乃至與免疫系統(tǒng)之間的相互作用，是一個(gè)復(fù)雜的過程。

3 A-NK的協(xié)同效應(yīng)和調(diào)節(jié)因素

越來越多的學(xué)者開始探索免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)A-NK的輔助作用。GuS發(fā)現(xiàn)腫瘤局部注射弗氏佐劑（Freund'scompletead juvant）能有效促進(jìn)A-NK的選擇性聚集，延緩腫瘤生長[14]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，WhitesideTL等以環(huán)磷酰胺（Cyclophos phamide）和苯丙噻嗪（Benzothiazoles）與A-NK/ IL-2聯(lián)合作用，都取得了明顯的協(xié)同抗瘤效應(yīng)[15]。英國學(xué)者Gold farb以A-NK做載體，在不影響效應(yīng)細(xì)胞變形性和細(xì)胞活性前提下連接免疫抑制劑阿霉素（Doxorubicin），表現(xiàn)出對(duì)靶細(xì)胞獨(dú)特的化學(xué)治療作用，而且避免了化療帶來的不必要的全身性副作用，證實(shí)了這一方法的可行性，Goldfarb常規(guī)分離制備A-NK是用尼龍毛法去除單核巨噬細(xì)胞，避免其對(duì)A-NK的增殖和細(xì)胞毒的抑制作用[16]。有文獻(xiàn)表明苯丙氨酸甲酯（PME）可有效去除單核巨噬細(xì)胞而不改變淋巴細(xì)胞的表型和細(xì)胞毒性，是一種簡便快速的制備方法。Trozzi采用此法獲得的腎癌患者A-NK的增殖活性和殺傷能力都有所增強(qiáng)。在肝癌患者A-NK制備上鄭寧等也取得了類似效果。并且提出，苯乙酸（PA）是苯丙氨酸在人體內(nèi)的自然代謝產(chǎn)物之一，它對(duì)于腦瘤、前列腺癌、肺癌、腎癌等多種腫瘤都具有抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用。經(jīng)苯乙酸預(yù)處理的腫瘤細(xì)胞上清液對(duì)A-NK增殖和殺傷活性的抑制作用明顯減弱，表明苯乙酸可以減少腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制因子，拮抗腫瘤對(duì)于生物治療療效的抑制，從而發(fā)揮協(xié)同抗瘤作用[17]。

德國的Moller P應(yīng)用IL-2， IL-7活化A-NK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者都可單獨(dú)刺激A-NK擴(kuò)增，但I(xiàn)L-7的效果較差，兩者結(jié)合可誘發(fā)更好的擴(kuò)增和殺傷效果，同時(shí)對(duì)惡性黑色素有一個(gè)選擇性的殺傷，而對(duì)非惡性角化細(xì)胞株和正常纖維母細(xì)胞則無此作用[18]。但Sedlmayr P報(bào)道盡管有IL-2和其它生長因子存在的情況下在進(jìn)展性惡性黑色素瘤和腎癌患者單個(gè)核細(xì)胞中誘導(dǎo)的CD3-CD56+細(xì)胞和正常獻(xiàn)血者比較，不論是誘導(dǎo)的數(shù)量還是A-NK細(xì)胞的殺傷活性都較正常獻(xiàn)血者誘導(dǎo)的A-NK偏低[19]。我們的研究證實(shí)用IL-4/IL-2或IL-12/IL-2聯(lián)合應(yīng)用可獲得更理想的誘導(dǎo)活性[20-22]。

4 A-NK的臨床應(yīng)用

A-NK最早應(yīng)用于臨床是1988年，Melder用A-NK/IL-2療法治療腎癌和黑色素瘤患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)LAK/IL-2療法有效的腫瘤對(duì)A-NK/IL-2療法也有效[23]。但A-NK的生物學(xué)特性和體內(nèi)分布情況已表明，這種細(xì)胞容易附壁，在血管中運(yùn)行不良，所以臨床上不宜全身給藥，局部治療是理想的途徑。1990年意大利Mu nari[24]采用PBL源性A-NK/IL-2治療惡性膠質(zhì)瘤，初步證實(shí)了腫瘤原發(fā)部位直接注射效應(yīng)細(xì)胞是行之有效的方法。1994年Boiardi等應(yīng)用此法治療9例膠質(zhì)瘤術(shù)后患者，通過手術(shù)時(shí)放置的\"Ommayatube\"將A-NK/IL-2直接注入手術(shù)殘腔內(nèi)。結(jié)果有效率為33%（1例完全治愈、2例部分治愈、4例進(jìn)入穩(wěn)定期、2例病情進(jìn)展）。分析原因Boiardi提出：①雖然治療過程中檢測了腦脊液中IL-2濃度（達(dá)1800～3600IU ml）在體外足夠維持效應(yīng)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒作用，但手術(shù)殘腔內(nèi)的壞死灶分泌的TGFβ或PGE2可能限制效應(yīng)細(xì)胞的殺傷功能：②雖然所有患者腫瘤都復(fù)發(fā)了，但其與常規(guī)療法有所區(qū)別的是，常規(guī)治療后90%以上腫瘤復(fù)發(fā)部位是在距原發(fā)灶3cm之內(nèi)，而A-NK治療后的復(fù)發(fā)部位的60%都發(fā)生在距導(dǎo)管邊緣（thecathetertip）2cm之外；③由于放療作用導(dǎo)致了原發(fā)灶周圍組織纖維化，阻止了效應(yīng)細(xì)胞的滲透和作用的發(fā)揮。但腔內(nèi)注射法對(duì)晚期患者和失去手術(shù)機(jī)會(huì)的腫瘤來說意義不大。除了給藥途徑，臨床上如何獲得足夠質(zhì)和量的PBMNC源性A-NK，也是治療能否成功的關(guān)鍵。腫瘤患者接受大劑量放療和化療后，使獲得足夠量優(yōu)質(zhì)的A-NK帶來一定困難，而進(jìn)展期腫瘤患者的A-NK的質(zhì)量往往不及病情穩(wěn)定期患者及正常人。在血液病患者中這種情況較為明顯[25]。Verfaillie和Lotz oua等學(xué)者分別報(bào)道過慢性髓細(xì)胞性白血患者在病情進(jìn)展期分離得到的A-NK的體外增殖能力和細(xì)胞毒性均比慢性期患者低，而緩解期非淋巴細(xì)胞白血病可以分離培養(yǎng)出較高抗癌活性的A-NK細(xì)胞。對(duì)于實(shí)體瘤患者，這種現(xiàn)象相對(duì)較少[26]。Schwarz等學(xué)者對(duì)33例肝腫瘤患者進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，比較其中6例良性腫瘤，10例原發(fā)肝癌和17例轉(zhuǎn)移性肝癌A-NK擴(kuò)增能力與良性腫瘤患者一致，均可以達(dá)到較高水平[27]。我們在臨床治療中采用胎兒臍帶血細(xì)胞作為A-NK來源，實(shí)踐證明可獲得足夠數(shù)量的A-NK細(xì)胞用來滿足臨床的治療需要。我們用A-NK細(xì)胞對(duì)人直腸癌CC95裸鼠移植癌進(jìn)行治療取得了較為滿意的結(jié)果[28，29]。

Basse PH研究了粘附的和非粘附的A-NK通過不同途徑對(duì)治療效果的影響，將上述兩種細(xì)胞用125IUdR進(jìn)行標(biāo)記，調(diào)查它們在血液循環(huán)中和腫瘤局部及組織中的分布情況。發(fā)現(xiàn)靜脈注射的A-NK細(xì)胞絕大部分分布在肺臟，只有不到15%到達(dá)其它器官；在左心室注射后較多的A-NK分布到肝，腎和內(nèi)臟，24h后各個(gè)器官的A-NK所剩不多；經(jīng)門靜脈注射的細(xì)胞在肝臟累積的A-NK較多，24h后仍然有40%以上A-NK細(xì)胞在肝臟停留，結(jié)果提示如果想增加細(xì)胞在特定器官的蓄積量，那么應(yīng)該直接輸入該器官的營養(yǎng)血管為宜，這樣才能達(dá)到較好的蓄積和治療效果[30]。Basse PH還應(yīng)用鐵蛋白預(yù)先標(biāo)記A-NK細(xì)胞用熒光顯微鏡觀察，證實(shí)輸注的A-NK細(xì)胞能夠?qū)h(yuǎn)離腫瘤病灶，血管外的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞緊密接觸，從而發(fā)揮抗轉(zhuǎn)移作用[31]。

Basse P用瑩光染料標(biāo)記A-NK細(xì)胞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究它們在各個(gè)器官累計(jì)和分布以及代謝情況獲得的獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與此類似。

縱觀全球，NK細(xì)胞（含A-NK）仍主要限于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，國外的臨床試驗(yàn)開展的并不廣泛[32-34]，主要集中于美國，歐洲和日本。國內(nèi)除我們外尚無先例性報(bào)道，從我們治療的情況來看治療是安全的，實(shí)驗(yàn)室方面嚴(yán)格管理，層層把關(guān)，護(hù)理方面審慎操作，一絲不茍，至今尚未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)熱和過敏等毒、副反應(yīng)發(fā)生[35，36]，本課題組申報(bào)的A-NK細(xì)胞臨床治療已經(jīng)被黑龍江省衛(wèi)生廳和物價(jià)局列為正式新型治療手段批準(zhǔn)在臨床應(yīng)用[37]。我們期待會(huì)有一個(gè)更好的臨床療效面世，以饗讀者，同時(shí)回饋廣大患者群體的殷切希望。

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編輯/哈濤