摘要：目的 通過對(duì)多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者聯(lián)合化療前后免疫球蛋白重鏈（Immunoglobulin heavy chain，IgH）基因重排進(jìn)行定量分析，探討IgH基因重排在MM發(fā)病機(jī)制中的作用，及重排拷貝數(shù)與預(yù)后及療效間的關(guān)系。方法 選用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，檢測(cè)并比較15例MM患者化療前后IgH基因重排拷貝數(shù)變化，培養(yǎng)U266細(xì)胞株和K562細(xì)胞作為陽性及陰性對(duì)照，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)秩和檢驗(yàn)，化療前后IgH基因重排拷貝數(shù)變化有顯著差異（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 MM患者經(jīng)過聯(lián)合化療后， IgH基因重排拷貝數(shù)比化療前有明顯降低。從而可以作為判斷MM治療療效的一種檢測(cè)方法，并對(duì)患者的預(yù)后判斷有指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR；多發(fā)性骨髓瘤；IgH重排

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白的異常漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)惡性增殖為特征的 B細(xì)胞系惡性腫瘤，其特征為血清單克隆性免疫球蛋白、溶骨性骨骼破壞、病理性骨折、骨痛、高鈣血癥和貧血。其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的進(jìn)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RQ-PCR）技術(shù)近年來發(fā)展起來并已開始用于臨床，本實(shí)驗(yàn)以免疫球蛋白重鏈基因重排來研究MM的發(fā)病機(jī)制，通過用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)MM患者聯(lián)合化療前后IgH基因重排拷貝數(shù)的變化，探討實(shí)時(shí)熒光定量PCR法是否可作為判斷MM治療療效的一種檢測(cè)方法，并對(duì)患者的預(yù)后判斷是否有指導(dǎo)意義。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1細(xì)胞株 K562細(xì)胞株（慢性粒細(xì)胞白血病急性變細(xì)胞系）由昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床試驗(yàn)研究中心王秦秦教授惠贈(zèng)；U266細(xì)胞株（多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系）由上海長(zhǎng)征醫(yī)院侯建教授惠贈(zèng)。將U266細(xì)胞作為多發(fā)性骨髓瘤的陽性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品，K562細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

1.2病例 收集2008年8月～2009年3月在云南省昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科住院治療的15例確診的MM患者。診斷療效標(biāo)準(zhǔn)參照《血液病治療及療效標(biāo)準(zhǔn)》[1]，其中初診患者3例，定期入院化療患者12例，男9例，女6例，年齡53～79歲，平均年齡62.1歲。IgG型患者9例，未分泌型患者4例，IgA型患者1例，輕鏈型患者1例。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1標(biāo)本采集 取患者應(yīng)用聯(lián)合化療（VAP方案或VAMP方案或VAD方案或VCMP方案或沙利度胺）前及從注射化療藥物后1個(gè)月的骨髓2～3ml或外周血5ml，于枸櫞酸鈉抗凝管中保存在4℃冰箱中以備提取單個(gè)核細(xì)胞。

1.3.2單個(gè)核細(xì)胞提取 ①取標(biāo)本3-5ml，于枸櫞酸鈉管中垂直靜置，加入等量PBS。②取一支新的15ml離心管，加入淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll分離液）3ml，取上步處理過的標(biāo)本貼管壁緩慢注入，使之形成上下兩層，輕放入離心托中，再用天平配平，放入離心機(jī)中，室溫下3000rpm20min離心后輕輕取出，不要震蕩，會(huì)發(fā)現(xiàn)試管中部有白色薄薄的單個(gè)核細(xì)胞層，用1ml移液器輕輕將其吸出后，置入另一支15ml離心管中。③再加入等體積的蒸餾水混勻，室溫放置5min后，再倍比加入1.8%Nacl輕輕混勻洗滌，3000rpm離心15min。④棄上清，留取沉淀。加入1mlPBS液混勻，用1ml移液器吸出后置入2ml離心管中，放入-20℃冰箱中凍存，以備DNA提取之用。

U266細(xì)胞株和K562細(xì)胞株省略以上步驟，經(jīng)PBS洗滌后可直接提取DNA。

1.3.3患者標(biāo)本DNA提取：按Genomic DNA Purification Kit試劑盒操作說明提取基因組DNA，（本試劑盒購于Fermentas 公司）。

1.3.4細(xì)胞培養(yǎng) 含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)并傳代。（胎牛血清購于杭州四季青公司；RPMI1640培養(yǎng)液購于hyclone公司）

1.3.5細(xì)胞株DNA提取 按Genomic DNA Purification Kit試劑盒操作說明提取基因組DNA，（本試劑盒購于Promega 公司）。

1.3.6引物設(shè)計(jì) ：IgH通用PCR引物來源于文獻(xiàn)[2]，上游引物為5，-ACA CGG CCG TGT ATT ACTGT-3，下游引物為5- ACC TGA GGA GAC GGT GAC C-3；管家基因Beta-actin 用Primer Express 5.0設(shè)計(jì)，在genebank中登陸序號(hào)為：NM_001101?；蛐蛄?5-1212，產(chǎn)物片段110bp。核苷酸序列為：601 gccgtcaggc agctcgtagc tcttctccag ggaggagctg gaagcagccg tggccatctc；661 ttgctcgaag tccagggcga cgtagcacag cttctcctta atgtcacgca cgatttcccg；721 ctcggccgtg gtggtgaagc tgtagccgcg ctcggtgagg atcttcatga ggtagtcagt（注加粗的為 Beta-actin上下游引物序列）。兩對(duì)引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.3.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 在7300型熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。步驟：融解所需試劑及標(biāo)本，振蕩混勻，短暫離心后，于光學(xué)專用8連管中配置反應(yīng)體系。IGH基因 PCR擴(kuò)增體系：模板DNA：2ul；上游引物：0.3ul；下游引物：0.3ul；SYBR Green I Real time PCR Master Mix：6.75ul；雙蒸水：5.65ul，總體積15ul.PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性10min； 95℃變性15s；57℃退火20s；68℃延伸1min；共40個(gè)循環(huán)。引物根據(jù)說明書稀釋。反應(yīng)均設(shè)一陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

1.3.8定量方法 根據(jù)參考文獻(xiàn)，比較化療前后IGH基因拷貝數(shù)變化用比較CT值法做相對(duì)定量，用數(shù)學(xué)公式2-ΔΔCT 分析相對(duì)基因表達(dá)差異。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)秩和檢驗(yàn)（數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布）。

2結(jié)果

2.1患者DNA含量和純度 患者DNA得率為1～2ug/g，其吸光度OD260/OD280（純度值）為>1.7.

2.2管家基因Beta-actin實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果 見圖1，圖2。

30份標(biāo)本加入管家基因Beta-actin后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，得出以上擴(kuò)增曲線，在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，其CT值與原始拷貝數(shù)成反比。

以上30份Beta-actin的融解曲線分析，融解曲線的峰值在86.4℃。由于非特異產(chǎn)物（引物二聚體）的解鏈溫度（Tm）相對(duì)特異產(chǎn)物低，利用融解曲線可將特異和非特異產(chǎn)物分開。

2.3患者IgH基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果 見圖3，圖4。

2.4試驗(yàn)數(shù)據(jù) 見表1。

2.5 統(tǒng)計(jì)結(jié)果 15例患者化療前后Beta-actin基因CT值經(jīng)配對(duì)T檢驗(yàn)，P=0.172，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。認(rèn)為Beta-actin基因拷貝數(shù)在化療前后無顯著差異，可以作為管家基因。

3討論

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM） MM是漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤，占血液系統(tǒng)腫瘤的10%，全身惡性腫瘤的1%，并有逐年遞增的趨勢(shì)。

MM發(fā)病機(jī)制尚不明確，IgH基因重排作為MM 發(fā)病機(jī)制新的研究方向，國(guó)內(nèi)外研究者已有相關(guān)報(bào)道[3]。80年代，國(guó)外學(xué)者用Southern blot技術(shù)檢測(cè)IgH基因重排。Oster等[4]檢測(cè)20例MM患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，8例有 IgH基因重排。Riet等[5] 用免疫磁化法分離出B細(xì)胞，檢測(cè)12例患者骨髓及外周血，骨髓中9例陽性，外周血僅2例陽性。Ralph等[6] 用PCR技術(shù)檢測(cè)了21例MM患者的骨髓涂片，16例陽性（76.1% ）。Trainor 等 檢測(cè)10例MM外周血，陽性者6例。雖然利用定性PCR檢測(cè)MMIgH重鏈重排已取得了較大的進(jìn)展，但是費(fèi)時(shí)、步驟繁瑣、假陽性高。Dobbs等采用熒光定量 PCR 方法，對(duì) 140例 B淋巴細(xì)胞系統(tǒng)惡性腫瘤（ALL，CLL，MCL，）患者的淋巴結(jié)、外周血、骨髓和石蠟組織檢測(cè) IgH基因重排，結(jié)果56例檢測(cè)到 IgH基因重排，與常規(guī)的PCR方法相比，敏感性為88.9%，特異性 100%。研究表明，使用熒光定量PCR檢測(cè) IgH基因重排是一種可靠的檢測(cè)方法，可以對(duì)判斷治療的療效及預(yù)后提供一種新的衡量指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)中MM患者采用化學(xué)治療的方案有：VAP（長(zhǎng)春新堿，阿霉素、潑尼松）方案、VAD方案、MP方案、VAMP（長(zhǎng)春新堿，馬法蘭，阿霉素、潑尼松）方案、VCMP方、VAD聯(lián)合沙利度胺、沙利度胺聯(lián)合潑尼松、VAMP聯(lián)合沙利度胺。入選試驗(yàn)中的15例患者，分別在化療前及正規(guī)化療一療程后采集骨髓液或外周血并提取DNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)IgH基因重排拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可得P<0.05，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為化療后IgH基因重排拷貝數(shù)較化療前有顯著差異。本實(shí)驗(yàn)中采用比較CT值法做相對(duì)定量，反應(yīng)的是拷貝數(shù)的相對(duì)變化，在目前的研究中，拷貝數(shù)究竟下降多少倍才達(dá)到完全緩解還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但我們通過比較化療前后拷貝數(shù)的變化并結(jié)合臨床資料綜合分析，可以對(duì)化療療效做出初步判斷，并可能對(duì)預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。

參考文獻(xiàn)：

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[2]林法迎，侯 建等. 實(shí)時(shí)定量 PCR監(jiān)測(cè) MM患者反應(yīng)停治療后微小殘留病[J]. 上海免疫學(xué)雜志，2003，23（ 4）.

[3] Gibson UE， CA Heid and PM Willianms. A novel method for real time quantitative RT-PCR.Genome Res.1996.6：995-1001.

[4]Oster W， Linelemann A， Mertelsmamn R， et al. Minimal peripheral blood cells carrying elonal markers of B cell disorderaI evidence for monoetonality of circulating tyropho- eytes in patients with multiple myeloma.Intern J cell Cloning，1989，7：111.

[5]Rlet IV. Heirman C. Lacor P， et al. Detection of monoclonal B lymphocytes in bone marrow and peripheral of multiple myeloma patients by immunogtobulin gene rearrangement studies.Br J Haematol，1989.73：289.

[6]Ralph QM， Briseo MJ， Joshul DE， et al. Advancement of multiple myeloma from disease through plateau phase to progression does not involve a new B-cell c Lone：evidence from the immunnglobin heavy chain gene.BLood，1993.88：202.

編輯/王海靜