鄭文虎等

摘 要 采用分子生物學(xué)技術(shù)對田間疑似植原體侵染引起的小葉癥狀的黃燈籠辣椒樣品進(jìn)行檢測，以明確其病原分類地位。利用植原體通用引物對R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，對上述黃燈籠辣椒葉片DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明：獲得約1.2 kb的特異片段，經(jīng)序列測定、Blast同源性檢索及進(jìn)化樹和iPhyClassifier分析，獲得該特異片段長為1 248 bp，與植原體16S rⅡ組中的花生叢枝植原體（L33765）同源性最高，達(dá)99%，聚類在同一個進(jìn)化枝上，相似性系數(shù)為1.00，歸屬于16S rII-A亞組。暫將其命名為黃燈籠辣椒小葉植原體（Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma，CcJLL）。

關(guān)鍵詞 黃燈籠辣椒小葉??；植原體；16S rDNA；分子鑒定

中圖分類號 S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Molecular Identification of the Pathogen of Capsicum

chinense Jacquin Little-leaf Disease in Hainan

ZHENG Wenhu1，2， CHE Haiyan1*， YANG Yi1， CAO Xueren1， LUO Daquan1**

1 Environment and Plant ProtectionInstitute，CATAS/Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Tropical Grops，Ministry of Agriculture，P.R.China/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control

of Tropical Agricultural Pests，Haikou，Hainan 571101， China

2 Sanya Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Sanya， Hainan 572000，China

Abstract In the paper， to ascertain taxonomic status of pathogen，Capsicum chinense Jacquin samples with little leaf symptom which were suggestive of phytoplasma infection，were detected by molecular biology. Primers R16mF2/R16mR1 and R16F2n/R16R2 were used to amplify the DNA samples from symptoms above by nested PCR. The PCR products were sequenced and Blast searching in GenBank. The phylogenetic tree and iPhyClassifier analysis of the 16S rDNA sequences showed that the sequence shared the identity of 99% with that from Peanut witches'-broom（L33765）， and clustered in the same clade， with similarity coefficient of 1.00. The phytoplasma belonged to 16S rII-A subgroup，was tentatively named as Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma，CcJLL.

Key words Capsicum chinense Jacquin little leaf disease；Phytoplasma；16S rDNA；Molecular identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.024

植原體（phytoplasma）是一類能引起植物病害的重要病原物，已在1 000余種罹病植物中檢測到該病原物，給世界各地的經(jīng)濟(jì)作物造成很大損失[1]。在中國，能夠造成嚴(yán)重危害的植原體病害主要有棗瘋病、泡桐叢枝病、檳榔黃化病等[2-4]。由于植原體不能人工培養(yǎng)，影響了對其進(jìn)行分類等方面的深入研究，但是隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，其分類鑒定依據(jù)逐漸豐富起來。Lee等[5]在2000年綜合分析了植原體16S rRNA和核糖體蛋白基因的序列，形成了一個包括19個組和46個亞組植原體種類的分類體系，為后來植原體的分類打下了基礎(chǔ)，在植原體的分類上具有重要意義。

黃燈籠辣椒（Capsicum chinense Jacquin），又名黃帝椒、黃辣椒，是海南特有的辣椒品種，適宜在海南的東南、西南沿海地區(qū)栽培，含有豐富的辣椒素、維生素C、胡蘿卜素及多種礦物質(zhì)[6]。目前，國內(nèi)外相關(guān)研究者在辣椒上發(fā)現(xiàn)多種植原體病害，田間表現(xiàn)為葉片黃化、矮縮、小葉、叢枝、變?nèi)~、結(jié)果量減少及果實變小等癥狀，這些植原體屬于16S rⅠ組、16S rⅢ組，16S rⅥ組、16S r Ⅻ組等[7-11]。黃燈籠辣椒在田間常見的病害為病毒病[12-13]，其它病害的研究報道很少。筆者在田間調(diào)查過程中首次在海南省儋州市寶島新村發(fā)現(xiàn)了疑似被植原體侵染而表現(xiàn)小葉癥狀的黃燈籠辣椒樣品，本研究擬采用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法對上述樣品進(jìn)行檢測和分析，以明確其病原及分類地位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 3株表現(xiàn)典型小葉癥狀的黃燈籠辣椒樣品采自海南省儋州市寶島新村，分別編號為PH1、PH2和PH3。健康黃燈籠辣椒樣品與上述3株樣品采自同一田塊。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 E. coli Competent Cell DH5α、克隆載體pMD18-T購自大連寶生物（TaKaRa）公司。

1.2 方法

1.2.1 植物總DNA提取 參照Lee等[14]的方法進(jìn)行樣品總DNA的提取置于-20 ℃貯存。

1.2.2 植原體16S rDNA基因的巢式PCR擴(kuò)增和克隆 根據(jù)Gundersen等[15]和Lee等[16]報道的引物對擴(kuò)增植原體16S rDNA基因片段序列，以R16mF2/R16mR1作為第一引物對，R16F2n/R16R2作為第二引物對，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。引物對序列如下：

R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′；

R16mR1：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′；

R16F2n：5′-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3′；

R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCC

CG-3′。

引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

巢式PCR第一次和第二次反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 17.3 μL， 10×Taq buffer（Mg2+）2.5 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL， DNA模板 1.0 μL， Taq DNA polymerase（5 U/μL） 0.2 μL。

巢式PCR第一次和第二次反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性1 min， 45 ℃退火1 min， 72 ℃延伸2 min， 進(jìn)行5個循環(huán)； 94 ℃變性30 s，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行25個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。以健康植株總DNA為對照。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物以TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 純化回收，將目標(biāo)產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，利用菌落PCR反應(yīng)篩選陽性克隆。

1.2.3 序列測定與分析 序列測定委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。利用DNAMAN（6.0.3.99版本）分析軟件進(jìn)行序列裝配；利用基因數(shù)據(jù)庫GenBank中的BLAST程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行同源性檢索；進(jìn)化樹分析采用MEGA4.0.2，采用最大簡約法 Maximum Parsimony 分析，使用近鄰交換算法 Close-Neighbor-Interchange 完成，以 1 000為重復(fù)值進(jìn)行 Bootstrap效驗；使用植原體分類鑒定的在線軟件iPhyClassifier（http：//plantpathology.ba.ars.usda.gov）對16S rDNA序列進(jìn)行RFLP電子酶切。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀表現(xiàn)

罹病黃燈籠辣椒植株表現(xiàn)矮化，高度僅為健康植株的1/2左右，葉片短小叢生，葉面積不足健葉的1/5，葉脈扭曲呈疙瘩節(jié)狀，葉色略微發(fā)黃，葉肉變?。▓D1）。

2.2 PCR檢測結(jié)果

利用植原體通用引物對從表現(xiàn)小葉癥狀的黃燈籠辣椒葉片總DNA中擴(kuò)增到大小約1.2 kb的特異片段，片段大小與Lee等[16]報道的相符，而健康黃燈籠辣椒葉片總DNA和空白對照均未出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶（圖2）。

2.3 植原體16SrDNA基因片段的序列分析

將PH1、PH2和PH3樣品中擴(kuò)增到的特異片段進(jìn)行純化、克隆及測序。結(jié)果表明，上述3個樣品的16S rDNA擴(kuò)增片段的測序結(jié)果相同，均含有1 248個核苷酸，G+C的含量為47.36%，GenBank 登錄號為JQ957928。同源性檢索發(fā)現(xiàn)，與該序列同源性較高的均為16S rⅡ組中的植原體16S rDNA序列，其中與花生叢枝植原體（Peanut witches-broom phytoplasma，PnWB，GenBank 登錄號：L33765）的同源性最高，達(dá)99%，將該植原體株系暫命名為黃燈籠辣椒小葉植原體（Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma，CcJLL）。

2.4 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

黃燈籠辣椒小葉植原體與其它相關(guān)植原體株系構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）表明，黃燈籠辣椒小葉植原體（CcJLL）與植原體16S rⅡ組成員聚類在同一個進(jìn)化枝上，其中與16S rⅡ組成員PnWB（L33765）聚類在同一個小進(jìn)化枝上。

2.5 計算機(jī)模擬16S rDNA-RFLP電子酶切圖譜及相似系數(shù)分析

黃燈籠辣椒小葉植原體（CcJLL）16S rDNA序列的RFLP電子酶切圖譜（圖4）分析表明，黃燈籠辣椒小葉植原體（CcJLL）與16S rⅡ-A亞組中的花生叢枝植原體（Peanut witches-broom phytoplasma，GenBank 登錄號：L33765）相似性系數(shù)為1.00，而且17種酶的電子酶切圖譜完全一致，可見黃燈籠辣椒小葉植原體（CcJLL）屬于16S rⅡ-A亞組。

3 討論與結(jié)論

本研究利用植原體通用引物對從表現(xiàn)小葉癥狀的辣椒葉片總DNA中擴(kuò)增到植原體16S rDNA片段，該片段長1 248 bp，說明采集的樣品中存在植原體，進(jìn)一步通過Blast同源性檢索及進(jìn)化樹和iPhyClassifier分析確定該植原體為16SrⅡ-A亞組成員，暫將其命名為黃燈籠辣椒小葉植原體（Capsicum chinense Jacquin little-leaf disease phytoplasma， CcJLL），這是首次在黃燈籠辣椒上發(fā)現(xiàn)植原體的存在。Li等[11]在陜西楊凌發(fā)現(xiàn)辣椒上存在辣椒叢枝植原體（Pepper witchesbroom phytoplasma），屬于16S rⅠ-B亞組成員。該植原體與本研究中發(fā)現(xiàn)的植原體分屬于不同的組。由于植原體至今尚不能人工培養(yǎng)，影響了植原體的分類研究，目前僅利用16S rDNA等少數(shù)幾個基因?qū)χ苍w進(jìn)行分類，存在一定的局限性。相信隨著更多的植原體全基因組序列測定的完成，將會建立更加完善的分類方法和分類體系。

黃燈籠辣椒可開發(fā)成美味的調(diào)料，也可作為醫(yī)藥工業(yè)的原料，是海南最具發(fā)展?jié)摿Φ奶厣r(nóng)作物之一。本研究的黃燈籠辣椒小葉病樣品采自海南省儋州市寶島新村，發(fā)生病害面積很小，關(guān)于該病害對黃燈籠辣椒產(chǎn)業(yè)的影響還有待進(jìn)一步研究。鑒于黃燈籠辣椒小葉植原體與花生叢枝植原體16S rDNA基因序列間具有高度一致性，能同時在此類植物上取食的葉蟬、飛虱類昆蟲很可能是它們的共同介體，這還但有待于進(jìn)一步的研究。在黃燈籠辣椒小葉病發(fā)生地也未發(fā)現(xiàn)其他疑似植原體感染的植物。Vladimir等[10]在墨西哥的Baja California Sur州發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)黃化癥狀的辣椒植株，通過檢測發(fā)現(xiàn)，該樣品中存在16S rⅫ組植原體和2種雙生病毒的混合侵染。本研究中表現(xiàn)小葉癥狀的辣椒樣品是否由CcJLL單獨侵染引起，還是存在其他植原體株系以及病毒的復(fù)合侵染，還有待于進(jìn)一步通過生物學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行驗證。

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責(zé)任編輯：林海妹