柴娟等

摘 要 在SDS法的基礎(chǔ)上，以富含多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)的香蕉葉片為材料，通過(guò)選擇性添加適量5 mol/L KAc（pH4.8）或不同體積無(wú)水乙醇分別提取香蕉葉片總核酸、總RNA（不含DNA）和總DNA（不含RNA）。結(jié)果表明：不添加KAc的可提取到總核酸；添加1/3體積和2/3體積的KAc得到總RNA，添加1/3體積無(wú)水乙醇處理得到總DNA。該結(jié)果獲得一種簡(jiǎn)單、快速，能在1次實(shí)驗(yàn)中添加不同試劑提取香蕉葉片總核酸、總RNA和總DNA的新方法。

關(guān)鍵詞 香蕉葉片；總核酸；總RNA；總DNA；快速提取

中圖分類(lèi)號(hào) S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

A New Method of Total Nucleic Acid， Total RNA and

Total DNA Isolation from Banana Leaves

CHAI Juan1，2， FENG Renjun2， SHI Hourui1，2， REN Mengyun1，2

WANG Jingyi2 *， ZHANG Yindong1，2 *

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Institute of Tropical Bioscience

and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（CATAS）， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Total nucleic acid， total RNA（no DNA）and total DNA（no RNA） were isolated from banana leaves， with high polysaccharides， polyphenols and other secondary metabolites， using the method based on SDS by selectively adding suitable 5 mol/L KAc（pH4.8）and different volume of absolute alcohol. The results indicated that total nucleic could be isolated without KAc， and total RNA could be obtained with 1/3 or 2/3 volume of KAc， and total DNA could be gotten with 1/3 volume of absolute alcohol. Various nucleic acids extracted in one experiment could meet the demands of molecular biology experiment with adding the type of reagent. It is a fast and simple method.

Key words Banana leaves； Total nucleic acid； Total RNA； Total DNA； Rapid extraction

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.017

從植物組織中提取RNA和DNA是進(jìn)行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提。高質(zhì)量的RNA是基因克隆表達(dá)、RT-PCR、cDNA文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)的原材料，高質(zhì)量的基因組DNA是進(jìn)行如SSR 、AFLP 等分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)[1]。從文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，有許多植物就是由于未能有效地分離純化其組織中的RNA和DNA，阻礙其分子生物學(xué)方面研究的進(jìn)展。香蕉（Musa paradisiaca）為大型多年生草本果樹(shù)，屬芭蕉科芭蕉屬植物，是熱帶、亞熱帶地區(qū)最重要的水果之一。香蕉組織不僅具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，而且富含大量脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖和酚類(lèi)等物質(zhì)[2-5]。裂解細(xì)胞時(shí)，香蕉葉片中的酚類(lèi)在多酚氧化酶作用下被氧化成醌類(lèi)物質(zhì)，多糖會(huì)形成難容的膠狀物與RNA共沉淀下來(lái)，這些均會(huì)造成一定量 RNA的降解和丟失，從而影響到核酸的提取。因此，能否有效地去除這些干擾是提取高質(zhì)量香蕉核酸成敗的關(guān)鍵[6-7]。目前，提取植物總核酸的方法主要有異硫氰酸胍法、CTAB法、SDS 法、Trizol 法等[8-9]。王尉等[10]在SDS法的基礎(chǔ)上改用LiCl沉淀RNA，成功提取了香蕉葉片較高質(zhì)量的RNA，但提取過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、效率低；王甲水等[5]利用改良CTAB法提取香蕉根系總RNA，但提取結(jié)果不理想，出現(xiàn)RNA的降解情況；王暑輝等[11]利用Trizol法提取富含多糖多酚的側(cè)柏葉片總RNA，所得RNA呈現(xiàn)黏稠狀，經(jīng)電泳檢測(cè)RNA呈現(xiàn)粘連帶型，嚴(yán)重降解；而Shen等[12]利用在CTAB提取液中加入二氧化硅顆粒提取板栗和銀杏DNA，雖然提取結(jié)果較為理想，但提取過(guò)程復(fù)雜，成本較高。此外，上述每種方法只能提取總RNA或總DNA中的一種。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)中對(duì)所需核酸質(zhì)量的要求越來(lái)越高，而且類(lèi)型多樣，可能有的實(shí)驗(yàn)需要總核酸、部分實(shí)驗(yàn)需要總RNA、還有的需要基因組DNA，需分別提取總核酸、總RNA和基因組DNA，這樣不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還會(huì)因多次取材對(duì)植物造成傷害，尤其對(duì)于特別珍貴的實(shí)驗(yàn)材料和轉(zhuǎn)基因植物[13]傷害較嚴(yán)重。因此，本研究在SDS法的基礎(chǔ)上經(jīng)多次對(duì)核酸提取體系進(jìn)行優(yōu)化，探索出一種能分別快速提取植物總核酸、總RNA和總DNA的新方法。本方法前期處理簡(jiǎn)單，所需時(shí)間短，省時(shí)省力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 香蕉栽培品種為巴西蕉（Musa AAA Group），生長(zhǎng)于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田，常規(guī)栽培管理。

1.1.2 器皿與耗材處理 實(shí)驗(yàn)所用到的玻璃器皿用錫紙包好于180 ℃烘烤8 h以上或者200 ℃烘烤4 h以上；塑料耗材預(yù)先用兩層紗布包好，再侵入0.1% DEPC水中處理24 h以上，然后隔著紗布倒出DEPC水（可重復(fù)使用），121 ℃高壓蒸汽滅菌40 min。

1.1.3 提取液與試劑

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸的電泳檢測(cè)分析

用上述方法提取的總核酸、總RNA、總DNA電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1所示。利用改良SDS法可以提取香蕉葉片的高質(zhì)量總核酸，總核酸中沒(méi)有蛋白、多糖等物質(zhì)的污染，并且RNA和DNA條帶清晰、整齊（圖1-a）?？俁NA條帶中有28S rRNA、18S rRNA、16S rRNA、5.8S rRNA和5S rRNA，28S rRNA條帶的亮度約為18s rRNA條帶的2倍，而5.8S rRNA和5S rRNA條帶較弱，說(shuō)明總RNA完整性較好，沒(méi)有降解；其中，16S RNA可能是葉綠體的RNA[10]。而用SDS法提取的香蕉葉片總核酸條帶比較模糊，其中，RNA發(fā)生嚴(yán)重降解，點(diǎn)樣孔附近還有明顯蛋白等雜質(zhì)污染（圖1-b）。

總RNA提取結(jié)果表明：用1/3 體積KAc處理（圖2-1）和用2/3體積KAc處理（圖2-2）都能提取高質(zhì)量的總RNA，兩個(gè)泳道中均無(wú)DNA、蛋白和多糖干擾，且28S rRNA、18S rRNA、16S rRNA、5.8S rRNA及5S rRNA條帶清晰，純度高，無(wú)降解，完全符合Northern雜交、cDNA合成及文庫(kù)的構(gòu)建等要求。而用等體積KAc處理（圖2-3），RNA呈現(xiàn)彌散狀條帶，且點(diǎn)樣孔附近有少量雜質(zhì)污染，不能滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

總DNA提取結(jié)果表明：泳道中DNA條帶明亮清晰，無(wú)蛋白和多糖污染（圖3-1），符合PCR擴(kuò)增、Southern雜交等的實(shí)驗(yàn)要求。1/2 體積的無(wú)水乙醇處理所提取的DNA經(jīng)電泳檢測(cè)條帶很弱，說(shuō)明RNA提取量較低（圖3-2）。2/3體積的無(wú)水乙醇和等體積無(wú)水乙醇處理，幾乎檢測(cè)不到DNA條帶（圖3-3）。

2.2 核酸的紫外檢測(cè)分析

所提取的總核酸、總RNA和DNA的紫外吸光值見(jiàn)表1所示。利用改良的SDS法所提取的總核酸，先用不含RNA酶的DNA酶消化總核酸中的DNA，然后用水飽和酚和氯仿混合試劑進(jìn)行抽提1次，以去除DNA酶，得到不含有DNA的總RNA，總RNA經(jīng)紫外檢測(cè)其OD260/OD280在1.8～1.9 之間；所提取的總核酸用不含DNA酶的RNA酶消化總核酸中的RNA，然后用水飽和酚和氯仿混合試劑抽提一次，去除RNA酶，得到不含有RNA的總DNA，DNA經(jīng)紫外檢測(cè)其OD260/OD280為1.8～2.0之間，說(shuō)明總核酸中的RNA和DNA均符合相關(guān)數(shù)值指標(biāo)要求，二者純度均較高。SDS法所提取的總核酸中經(jīng)分離得到總RNA和DNA的方法同改良的SDS法相同，經(jīng)檢測(cè)其總RNA的OD260/OD280值為1.6～1.7之間；DNA的OD260/OD280比值為1.7～1.8之間，表明有多糖、蛋白等次生代謝物污染。

用改良的SDS法提取總RNA（RNA-1、RNA-2和RNA-3分別為圖2中的泳道1、2、3）經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其純度，結(jié)果表明：RNA-1 和RNA-2的OD260/OD280的值均在1.8～2.0 左右，說(shuō)明得到的RNA純度較高，而RNA-3的OD260/OD280為1.5～1.7之間，表明有蛋白等次生代謝物污染。

用改良的SDS法提取的總DNA（DNA-1和DNA-2分別對(duì)應(yīng)圖3中的泳道1和2）用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其純度，結(jié)果表明：DNA-1的OD260/OD280均在2.0左右，符合DNA純度檢測(cè)的相關(guān)數(shù)值指標(biāo)要求，說(shuō)明用此法提取的DNA純度較高；而DNA-2的OD260/OD280在2.1～2.3之間，大于2.0的指標(biāo)，說(shuō)明DNA發(fā)生了部分降解。

這說(shuō)明本研究利用改良的SDS法，經(jīng)多次優(yōu)化，可以有效地去除香蕉葉片中蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)，所提取的總核酸（總RNA和DNA）、總RNA和總DNA的純度較高。

2.3 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)利用改良的SDS法從香蕉葉片提取到的總RNA（分別用1/3 體積和2/3體積KAc處理）以及從總核酸中分離得到的總RNA分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以香蕉Actin1基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)RNA提取質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，從香蕉葉片中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中成功地克隆到大約241 bp的目標(biāo)片段。說(shuō)明該方法提取的香蕉總RNA具有較高的質(zhì)量，能滿(mǎn)足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。

3 討論與結(jié)論

與傳統(tǒng) RNA或DNA 提取方法相比較，本實(shí)驗(yàn)前期處理簡(jiǎn)單方便，只需要配制一套試劑，進(jìn)行1次取材，可同時(shí)提取植物總核酸、總RNA和總DNA，不僅節(jié)約了時(shí)間，而且節(jié)約了提取成本。此外，實(shí)驗(yàn)中所用的塑料耗材先采用紗布包裹，再侵入0.1% DEPC水中處理，不僅縮短了實(shí)驗(yàn)人員與有毒試劑的接觸時(shí)間，保證了實(shí)驗(yàn)人員的安全，同時(shí)減少了DEPC的揮發(fā)對(duì)環(huán)境造成的污染。從核酸的提取結(jié)果來(lái)看，本實(shí)驗(yàn)方法能有效抑制外源RNA酶對(duì)RNA的污染，提取的RNA和DNA的質(zhì)量和純度都較高，可以滿(mǎn)足多種分子生物學(xué)研究的需要，具有現(xiàn)實(shí)意義。

利用改良SDS法提取總核酸時(shí)，勻漿上清液不用KAc進(jìn)行處理，而直接采用水飽和酚和氯仿組成的混合試劑進(jìn)行抽提。理論上，當(dāng)用水飽和酚（pH≈5，呈酸性）進(jìn)行抽提時(shí)，RNA會(huì)溶解于酸性的水相，DNA處于有機(jī)相，從而把RNA與DNA分離。但實(shí)驗(yàn)表明，水飽和酚只能去除少量的DNA，所以本研究采用水飽和酚提取總核酸。同時(shí)，我們選用了改良前的SDS方法做了平行試驗(yàn)，提取結(jié)果表明（圖1和表1），改良SDS法提取香蕉葉片的總核酸效果較好。

改良SDS法提總RNA時(shí)，有效除去香蕉葉片中的酚類(lèi)、多糖等雜質(zhì)減少RNA的的丟失，是RNA提取成敗的關(guān)鍵。本研究通過(guò)在勻漿上清液中分別添加不同體積的高濃度酸性醋酸鉀溶液（pH值是4.8）進(jìn)行處理，再通過(guò)苯酚、氯仿抽提除去多糖，得到不含DNA的RNA樣品，以探索在香蕉葉片中提取高質(zhì)量RNA的最佳處理?xiàng)l件。結(jié)果表明，在上清液添加1/3 體積至2/3體積的5 mol/L KAc（pH4.8），獲得的總RNA質(zhì)量較高并具有較高的轉(zhuǎn)錄活性。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過(guò)苯酚、氯仿抽提可以除去多糖[15-18]，而酸性條件下有利于RNA的提取，不利于DNA的提取。所以，當(dāng)加入一定量的5 mol/L KAc（pH值是4.8）并低溫離心后，DNA和多糖等雜質(zhì)位于管底，而上清液中只有RNA。Bahloul等[19]提取云杉組織RNA時(shí)，在勻漿上清液中加入5 mol/L KAc溶液（pH4.8）使終濃度為1.25 mol/L，獲得的RNA質(zhì)量得到明顯改善。

提取基因組DNA時(shí)，本研究探索通過(guò)加入不同體積比（1/3體積、1/2體積、2/3體積和等體積）的無(wú)水乙醇達(dá)到有效去除RNA和多糖的目的。結(jié)果表明，當(dāng)在勻漿上清液中加入1/3體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行處理時(shí)，提取得到了不含RNA和多糖等雜質(zhì)干擾的DNA樣品。多糖和RNA具有相似的理化性質(zhì)極易形成共沉淀，所以，當(dāng)添加1/3體積的無(wú)水乙醇到勻漿上清液中時(shí)，剛好多糖與RNA形成共沉淀，離心后被丟棄，得到DNA；添加2/3體積和等體積的無(wú)水乙醇到勻漿上清液中時(shí)，無(wú)水乙醇將大部分DNA、RNA和多糖都沉淀下來(lái)，上清液中幾乎沒(méi)有DNA，最后就只能得到少量的DNA或者得不到任何物質(zhì)。徐志祥等[20]將提取得到的DNA 沉淀置于30%的乙醇中放置過(guò)夜，離心，上清液加80%的乙醇重新沉淀DNA，能有效去除多糖和其它雜質(zhì)，但提取過(guò)程操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。

綜上所述，本研究在改良SDS法的基礎(chǔ)上，通過(guò)適量添加不同體積的5 mol/L KAc和無(wú)水乙醇，對(duì)RNA、DNA的提取體系進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到同時(shí)快速提取植物總核酸、總RNA和總DNA的目的，不但獲得的 RNA 質(zhì)量高，純度也好，完全可以滿(mǎn)足進(jìn)一步從事相關(guān)分子生物學(xué)研究的要求，并且整個(gè)抽提過(guò)程不足3 h，相比于CTAB法（LiCl沉淀RNA去除多糖要求4 h以上或過(guò)夜）提取RNA或DNA來(lái)說(shuō)，具有快速、操作簡(jiǎn)單、獲取核酸質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，可為其它多酚、多糖和多次生代謝物質(zhì) 總RNA 的提取提供參考。

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責(zé)任編輯：趙軍明