曹紅星 黃漢駒 雷新濤 張大鵬 張如蓮

摘 要 以2年生的海南本地高種椰子和香水椰子2個(gè)椰子品種的幼苗為材料，根據(jù)溫度的日變化規(guī)律，設(shè)置4個(gè)不同的最低溫度處理，分別為CK（自然溫度處理）、16 ℃（T1處理）、12 ℃（T2處理）、8 ℃（T3處理），處理20 d后，對其植株的寒害癥狀及組織解剖結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明，隨著處理溫度的降低，葉片受傷害情況越來越嚴(yán)重，葉片結(jié)構(gòu)越來越不規(guī)則，尤其在T3處理下香水椰子的葉片結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形。葉片總厚度在不同低溫處理下變化明顯，可作為椰子抗寒種質(zhì)鑒定時(shí)的結(jié)構(gòu)指標(biāo)，海南本地高種抗寒性比香水椰子強(qiáng)。

關(guān)鍵詞 椰子；低溫處理；解剖結(jié)構(gòu)

中圖分類號 S667.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

椰子為棕櫚科椰子屬的喜溫樹種，是典型的熱帶木本油料作物和食品能源作物，在高溫和陽光充足的條件下生長發(fā)育良好。椰子要求年平均溫度在24～25 ℃以上，才能正常開花結(jié)果，一年中若有1個(gè)月的平均溫度為18 ℃，其產(chǎn)量則明顯下降，若平均溫度低于15 ℃，就會引起落花、落果和葉片變黃[1]。因此，低溫是影響椰子生長發(fā)育的重要限制因子，若椰子抗寒育種取得突破性進(jìn)展，對提高其在低溫季節(jié)的產(chǎn)量、擴(kuò)大種植范圍和面積，推動椰子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[2]。已有研究結(jié)果表明，低溫下葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化與抗寒性關(guān)系密切，通過研究野生歐洲李秋季和春季葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異發(fā)現(xiàn)，柵/海比（柵欄組織厚度/海綿組織厚度）和組織結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）與野生歐洲李的抗寒性顯著相關(guān)[3]；通過對14個(gè)早實(shí)核桃品種的抗寒性進(jìn)行綜合評價(jià)表明，葉片厚度、氣孔密度和柵/海比是影響抗寒性的主要葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)[4]；有的研究認(rèn)為抗寒性較強(qiáng)的植物在低溫處理過程中，柵欄細(xì)胞層數(shù)目多，葉脈密度較高[5]。植物葉片解剖結(jié)構(gòu)鑒定已成為評價(jià)植物抗寒性的重要方法，并應(yīng)用于不同種質(zhì)抗寒性鑒定的研究中[6-10]。因此，開展椰子葉片解剖結(jié)構(gòu)的研究對椰子抗寒種質(zhì)材料的篩選具有重要意義。

在椰子解剖結(jié)構(gòu)研究方面，對不同椰子品種的1年生幼苗葉片進(jìn)行解剖觀察和比較，初步推測4個(gè)品種的抗寒能力依次為本地高種（綠）、本地高種（褐）、馬來亞紅矮、馬來亞黃矮[11]。通過對5個(gè)椰子品種成年植株葉片解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，葉片的柵欄組織厚度和葉片厚度可以作為抗寒指標(biāo)，在供試品種中，抗寒性最強(qiáng)的是海南本地高種，抗寒性最弱的文椰4號（香水椰子）。但是關(guān)于低溫對椰子解剖結(jié)構(gòu)變化影響的研究還少見報(bào)道。本研究通過對2個(gè)椰子品種在低溫處理下葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化特性，篩選出與抗寒密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)指標(biāo)和抗寒種質(zhì)，為抗寒種質(zhì)資源的早期篩選鑒定和抗寒品種的培育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試2個(gè)品種分別為海南本地高種椰子和香水椰子，取自海南省文昌市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所育苗基地，選取生長健壯，長勢一致，無病害的2年生的盆栽苗。

1.2 方法

1.2.1 低溫脅迫處理 實(shí)驗(yàn)于2013年1月6～26日進(jìn)行，2個(gè)椰子品種分別選取生長一致的盆栽苗在植物光照培養(yǎng)箱中（型號：RXZ-280B）進(jìn)行低溫脅迫，以自然環(huán)境溫度為CK（溫度范圍18～22 ℃），根據(jù)自然條件下溫度的日變化進(jìn)行模擬，設(shè)置不同的最低溫度處理：T1（16 ℃）、T2（12 ℃）、T3（8 ℃）（表1）。各處理結(jié)束后，以頂端下第2～3片葉定為樣品葉進(jìn)行石蠟切片，同時(shí)觀察植株出現(xiàn)的寒害癥狀，每處理3株，重復(fù)3次。

1.2.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)的測定 取頂端以下第3片葉，從葉片中部切取，避開中部較大的葉脈，切成5 mm×3 mm小片，經(jīng)過材料固定、酒精梯度脫水（各20 min）、透明、浸蠟、包埋、按8～10 μm厚度切片、展片、番紅-固綠染色、中性樹膠封片、光學(xué)顯微鏡照相。制片后在Leica DM2500光學(xué)顯微鏡下物鏡40倍觀察拍照，用目鏡測微尺測量葉片厚度、上表皮厚度、上角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度、下角質(zhì)層厚度，并分別計(jì)算細(xì)胞緊密度（CTR）、疏松度（SR）。每個(gè)溫度處理觀察3個(gè)切片，每個(gè)切片取10個(gè)視野測定平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后采用SPSS軟件，對測定的解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下植株的寒害表現(xiàn)

分別對2年生椰子在不同低溫脅迫下植株的寒害情況進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)海南本地高種椰子在自然生長條件下（CK），椰子幼苗均生長正常，無萎蔫脫水的現(xiàn)象出現(xiàn)。隨著處理溫度的降低，植株受傷害情況逐漸加重。但是香水椰子在CK處理過程中，有輕度受害的現(xiàn)象出現(xiàn)，第17天開始出現(xiàn)葉片萎縮的現(xiàn)象，可能與實(shí)驗(yàn)處理期間外界環(huán)境溫度較低（CK處理的最低溫度18 ℃），香水椰子的抗寒性較差有關(guān)（表2）。

在T1處理下，海南本地高種椰子的葉片第5天出現(xiàn)萎縮，而萎縮一直持續(xù)到第17天才出現(xiàn)了輕度的折疊，第20天葉片才有緊縮的現(xiàn)象；香水椰子的葉片第5天出現(xiàn)萎縮，第13天萎蔫，第16天葉片緊縮，第20天葉片折疊收緊。

在T2處理下，海南本地高種椰子和香水椰子都是第5天出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，海南本地高種椰子第16天才出現(xiàn)輕度的折疊，第20天葉片折疊收緊現(xiàn)象較為明顯，而香水椰子第10天出現(xiàn)萎蔫，第20天出現(xiàn)水漬狀。

在T3處理下，海南本地高種椰子還是第5天出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，第14天輕度折疊，第20天嚴(yán)重折疊；香水椰子第3天就出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，第16天就出現(xiàn)水漬狀，受害嚴(yán)重，第20天葉片全部變褐，嚴(yán)重失水。

2.2 低溫脅迫下葉片的解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)比較

對2個(gè)不同椰子品種在低溫處理下椰子解剖結(jié)構(gòu)變化的顯微觀察發(fā)現(xiàn)，CK處理下的柵欄組織和海綿組織排列規(guī)則，但隨著溫度的下降，細(xì)胞間隙越來越大，排列越來越不規(guī)則；海綿組織邊緣規(guī)則，隨著處理溫度的降低，胞間隙擴(kuò)大，邊緣越來越不規(guī)則。

由圖1可以看出，海南本地高種椰子的葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密程度遠(yuǎn)高于香水椰子，在CK處理下，海南本地高種椰子的柵欄組織和海綿組織排列非常整齊﹑有規(guī)則，在T2和T3處理下，依然能保持著相對緊湊完整的葉片形態(tài)，只不過T3處理下海綿組織和柵欄組織的分界已經(jīng)開始模糊不清；而香水椰子細(xì)胞結(jié)構(gòu)在CK處理下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列不如海南本地高種椰子排列緊密，T2和T3處理下疏散，趨于破碎，尤其T3處理下，海綿組織和柵欄組織已不能區(qū)分，由此可知，海南本地高種椰子的葉片組織結(jié)構(gòu)比香水椰子更耐受低溫寒害影響，T3處理可能溫度較低對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察有一定的影響。

2.3 低溫脅迫下葉片組織解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較分析

海南本地高種椰子葉片組織解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)在不同低溫處理下的變化見表3，隨著處理溫度的降低，葉片總厚度都比CK有所降低，T1、T2、T3處理的葉片厚度與CK相比，分別減少了2.92%、17.96%、13.05%，CK和T2、T3處理分別達(dá)到顯著差異水平，但T3處理的反而比T2處理的高；柵欄組織厚度和葉片總厚度表現(xiàn)出相類似的變化趨勢；海綿組織厚度在不同低溫處理下變化不大，僅有T2處理和另外3個(gè)處理達(dá)到顯著差異的水平；組織緊密度（CTR）在不同溫度處理下比較穩(wěn)定，各處理之間都未達(dá)到顯著差異的水平；組織疏松度（SR）在不同低溫處理下變化不大，僅CK和T3處理達(dá)到顯著差異的水平；柵欄組織與海綿組織比（P/I）在不同溫度處理下也表現(xiàn)比較穩(wěn)定，各處理間都未達(dá)到顯著差異的水平。

香水椰子的葉片總厚度，隨著處理溫度的降低，葉片總厚度都比CK有所降低，T1、T2、T3處理的葉片厚度與CK相比，分別減少了23.50%、25.10%、6.47%，但CK和T3處理的葉片總厚度顯著高于T1和T2處理；柵欄組織厚度也表現(xiàn)出和葉片總厚度相類似的變化特征，T1、T2、T3處理的柵欄組織厚度與CK相比，分別減少了26.18%、27.07%、3.32%，CK和T3處理的柵欄組織厚度也顯著高于T1和T2處理；海綿組織厚度在低溫處理過程中變化差異較大，T1、T2、T3處理的葉片厚度與CK相比，分別減少了43.15%、33.33%、19.86%，CK和T1、T2、T3處理分別達(dá)到顯著差異的水平；組織緊密度（CTR）在不同溫度處理下變化不大，各處理間都未達(dá)到顯著差異的水平；組織疏松度（SR）在CK處理下值最高，和其他處理都達(dá)到顯著差異的水平，T1處理的值最低，T2和T3處理差別不大，未達(dá)到顯著差異的水平；柵欄組織與海綿組織比（P/I）在不同溫度處理下也表現(xiàn)比較穩(wěn)定，僅CK和T1處理間達(dá)到顯著差異的水平。

從以上研究結(jié)果可知，2個(gè)品種椰子的葉片總厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度都表現(xiàn)為和CK相比，T1和T2處理都較CK有較大幅度的下降，但T3處理反而比T1或T2處理的值有所上升，可能在T3處理下，葉片的結(jié)構(gòu)發(fā)生變形，細(xì)胞扭曲，細(xì)胞間隙加大，尤其是海綿組織和柵欄組織的分界已經(jīng)開始模糊不清有關(guān)，而且柵欄組織厚度和海綿組織厚度的變化不明顯，可能不宜作為低溫處理研究椰子解剖結(jié)構(gòu)的變化。CTR和P/I的值相對比較穩(wěn)定，SR值的變化相對較大。

3 討論與結(jié)論

研究不同低溫處理下植物耐寒相關(guān)指標(biāo)的變化是研究植物抗寒能力、評價(jià)植物抗寒性的重要方法。通過研究布迪椰子、沼地棕和油棕3種棕櫚植物在低溫鍛煉前（10月份）和低溫鍛煉后（次年1月份）所采的葉片在不同低溫處理時(shí)的電解質(zhì)滲透率變化趨勢不同，發(fā)現(xiàn)布迪椰子的耐寒力最強(qiáng)而且對降溫反應(yīng)速度最快，沼地棕居中，油棕耐寒力最弱，對溫度反應(yīng)最慢[12]；以伊麗莎白和玉金香2個(gè)甜瓜品種為材料，以正常自然溫度（25 ℃/18 ℃，12 h）為對照，研究了晝夜低溫（10 ℃/5 ℃，12 h）和夜間低溫（20 ℃/5 ℃，12 h）處理對甜瓜幼苗生長及根系生理指標(biāo)的影響，結(jié)果表明，與對照相比，晝夜低溫和夜間低溫處理7 d均顯著抑制了甜瓜幼苗生長，玉金香比伊麗莎白對低溫更加敏感[13]；以杜竹屬清甜竹、花吊絲竹和勃氏甜龍竹的盆栽苗為實(shí)驗(yàn)材料，測定了模擬低溫（0、-5、-10、-15、-20和-25 ℃和自然低溫（15、10、5、3、0和-2 ℃）條件下3個(gè)竹種葉片的形態(tài)變化以及相對電導(dǎo)率等抗寒相關(guān)指標(biāo)的變化，認(rèn)為3個(gè)竹種的抗寒性均較差，其中清甜竹的耐寒能力最弱[14]。本研究也是通過抗寒相關(guān)指標(biāo)在低溫處理下的變化，評價(jià)不同椰子品種的抗寒能力，與上述的研究方法相類似。

而葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的變化是植物對低溫等環(huán)境適應(yīng)的基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與其抗寒能力密切相關(guān)[15-16]。在本研究中，在T1、T2處理下，和CK相比，海南本地高種椰子和香水椰子的葉片總厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度都有所降低，但是僅有葉片總厚度在不同低溫處理下，差異表現(xiàn)較為明顯，可作為抗寒性的評價(jià)指標(biāo)，而柵欄組織厚度、海綿組織厚度在不同溫度處理下變化幅度不如葉片總厚度大，尤其是海南本地高種椰子的柵欄組織厚度和海綿組織厚度在不同處理下變化差異不明顯，不宜作為抗寒評價(jià)的指標(biāo)；上述3個(gè)指標(biāo)的香水椰子降低的幅度比海南本地高種椰子的大，可能與香水椰子在低溫處理下結(jié)構(gòu)變形較為明顯，抗寒性不如海南本地高種椰子強(qiáng)，這與以前的研究結(jié)果相類似[14-15]。但在T3處理下，葉片總厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度等反而比T2處理下有所增加，尤其是香水椰子增加的幅度較大，可能與T3處理的溫度太低，植株萎蔫直至嚴(yán)重脫水，細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形，柵欄組織與海綿組織難以準(zhǔn)確的區(qū)分有關(guān)[17-18]。

在利用葉片解剖結(jié)構(gòu)評價(jià)植物的抗寒性時(shí)，單一的葉片結(jié)構(gòu)參數(shù)受環(huán)境影響大，不能反映植物的抗寒能力，所以通常采用葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）和疏松度（SR）作為評價(jià)抗寒能力的指標(biāo)，通過對一些植物葉片組織解剖結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，品種的抗寒性與葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度呈正相關(guān)，與組織疏松度呈負(fù)相關(guān)[19-21]。但有的研究認(rèn)為SR和CTR等指標(biāo)與抗寒性關(guān)系不大[22-24]，本研究中也得出類似的結(jié)果，CTR、SR和P/I的值在低溫處理的過程中變化幅度較小，不宜作為抗寒評價(jià)的指標(biāo)。

通過對2個(gè)椰子品種葉片解剖結(jié)構(gòu)在低溫處理下的變化研究，認(rèn)為葉片總厚度在2個(gè)椰子品種的不同低溫處理下都變化明顯，可作為椰子抗寒種質(zhì)鑒定時(shí)的結(jié)構(gòu)指標(biāo)進(jìn)行運(yùn)用。香水椰子在CK處理下（最低溫度18 ℃），有輕度受害的現(xiàn)象出現(xiàn)；T1（最低溫度16 ℃）和T2（最低溫度12 ℃）對其傷害比較大，葉片變褐﹑結(jié)構(gòu)變形，葉片總厚度等結(jié)構(gòu)指標(biāo)的值降低幅度較大；T3（最低溫度8 ℃）處理下受到嚴(yán)重脅迫傷害，結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形，海綿組織和柵欄組織混淆，葉片總厚度等結(jié)構(gòu)指標(biāo)的數(shù)值反而有所上升。而海南本地高種椰子在CK處理下生長正常，T1處理對其結(jié)構(gòu)變化影響不大，T2和T3處理下仍能保持相對完整的葉片形態(tài)，葉片總厚度等結(jié)構(gòu)指標(biāo)在每個(gè)處理下的變化幅度小于香水椰子結(jié)構(gòu)指標(biāo)的變化幅度，表明海南本地高種椰子的抗寒性強(qiáng)于香水椰子。

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