宋健 邱雨 蘇迎春

[摘 要] 卵清蛋白是在鳥類卵清中大量存在的一種功能未知的蛋白。令人驚訝的是，卵清蛋白屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）家族，盡管它缺乏任何的抑制活性。卵清蛋白是鳥類卵清中最主要的蛋白，也是最早分離提純的蛋白之一。由于它具有可迅速大量制備的性質(zhì)，因此，在蛋白結(jié)構性質(zhì)研究以及過敏實驗模型中得到廣泛的應用。卵清蛋白在雞輸卵管中的合成以及它受到類固醇激素的調(diào)節(jié)，為蛋白合成與分泌研究提供了一個模型。

[關鍵詞] 卵清蛋白 絲氨酸蛋白酶 活性 免疫學機制

[中圖分類號] Q5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1003-1650 （2014）07-0234-01

一、絲氨酸蛋白酶抑制劑

絲氨酸蛋白酶抑制劑是一個含有300個以上同源蛋白的家族；它們在除了原核生物以外的動物、植物、昆蟲以及病毒中都有發(fā)現(xiàn)。它們包括人血漿中控制酶的凝固、溶血纖蛋白、補體以及激肽級聯(lián)的主要的絲氨酸蛋白酶抑制劑，以及激素結(jié)合球蛋白、血管緊張肽原和卵清蛋白等不具有任何抑制活性的蛋白。

作為蛋白酶抑制劑，serpins的功能活性依賴于它們獨有的一個能力，即與進攻的蛋白酶作用時發(fā)生戲劇性的構像轉(zhuǎn)變。天然serpin （圖1.1 a）具有一個極為柔軟的肽環(huán)，即反應中心環(huán)，它具有反應中心，能很好的模仿蛋白酶水解的底物。應用Schechter和Berger命名法，將被蛋白酶攻擊的中心肽鍵表示為P1-P1'，P1是切點的N端，P1'是C端。與大多數(shù)蛋白質(zhì)不同的是，天然serpin的折疊并不是熱力學支持的構像，而是一個亞穩(wěn)態(tài)的折疊中間體。它與靶蛋白酶作用時釋放結(jié)構張力導致反應中心環(huán)作為中間鏈插入中心-折疊（圖1.1 b）。環(huán)插入形式的穩(wěn)定性是天然構像體的兩倍。近來有報導表明反應中心環(huán)完全插入到-折疊中，是使蛋白酶失活所必需的。構像轉(zhuǎn)變釋放的能量被用來動搖和扭曲始終通過酯鍵在P1位與serpin結(jié)合的蛋白酶。Serpins產(chǎn)生構像轉(zhuǎn)變的能力允許對它們的活性進行嚴格的調(diào)控，并且提供了清除serpin-蛋白酶復合物的機制。然而，抑制性機制對這種復雜的結(jié)構轉(zhuǎn)變的依賴性導致serpins對于以下突變異常敏感：即阻礙環(huán)插入或是在蛋白水解攻擊時導致環(huán)插入（未成熟環(huán)插入）而導致功能喪失。未成熟環(huán)插入可能發(fā)生在分子內(nèi)（分子內(nèi)環(huán)插入）或兩個分子之間（分子間環(huán)插入）。導致serpin聚合的分子間環(huán)插入與多種疾病狀態(tài)有關，例如肝病和癡呆等。

抑制性serpins的這種復雜的控制機制顯示了這個家族在高等生物體中作為主要的蛋白酶抑制劑進化的成功。但是沒有抑制抑制功能的serpins又怎么樣呢？許多非抑制性serpins具有簡單的任務：激素結(jié)合球蛋白在循環(huán)中作為配體；血管緊張肽原唯一已知的功能是它的氨基端被腎素切割后會釋放一個短肽，在血壓控制中起作用。但是，卵清蛋白的功能至今未知。這是很有意思的。試想為什么這樣一個大而復雜的分子作為serpin卻只被賦予如此明顯簡單的任務？這吸引我們推測serpin結(jié)構可能具有未知的調(diào)整功能。

在公認的非抑制性serpin中，可以通過與典型的抑制性serpin序列比較來確定反應中心。在卵清蛋白中，反應中心是殘基353-354位的Ala-Ser，同時也是通過序列預測的胰肽酶E的唯一切點。有趣的是，一些非抑制性serpins明顯的保留了典型抑制性家族成員的反應中心環(huán)的可塑性。激素結(jié)合球蛋白，皮質(zhì)類固醇激素結(jié)合球蛋白及甲狀腺素結(jié)合球蛋白被活性噬中性粒細胞釋放的酶在其公認的反應中心處切割時，會產(chǎn)生特有的serpin構像轉(zhuǎn)變。在皮質(zhì)類固醇激素結(jié)合球蛋白中，構像的轉(zhuǎn)變伴隨著激素結(jié)合親和性的降低，這可能是發(fā)炎位點皮質(zhì)醇釋放的一個生理機制。其它非抑制性serpin，包括血管緊張肽原和卵清蛋白，沒有表現(xiàn)出在假定反應中心切割會產(chǎn)生大的構像轉(zhuǎn)變現(xiàn)象，這表示它們已經(jīng)喪失了它們抑制性祖先的極端可塑性。

二、卵清蛋白的應用研究

目前國內(nèi)外對于卵清蛋白的性質(zhì)研究不多，多用于致敏實驗。如研究速發(fā)型哮喘及晚發(fā)型哮喘與細胞因子關系，了解不同的細胞因子對不同類型哮喘的調(diào)節(jié)作用，探討其免疫學發(fā)病機制，以卵清蛋白致敏，激發(fā)建立小鼠哮喘模型。用BN 大鼠模型探討不同蛋白的過敏性，通過腹腔注射或口服給予BN 大鼠卵清蛋白（OVA） 或牛血清白蛋白（BSA）， 時間為6周在不同時間取血清，進行被動皮膚致敏試驗（PCA）；分離血漿進行組胺測定；此外，對OVA 組和對照組的大鼠進行血壓測定。結(jié)果：PCA試驗結(jié)果表明OVA 特異性IgE抗體滴度較高（1P32～1P128） ，而BSA特異性IgE抗體滴度較低（1P2～1P4）。與對照組相比，腹腔注射或口服OVA均使組胺水平升高?？诜﨩VA對大多數(shù)大鼠的血壓沒有明顯的影響。還有觀察口服卵清蛋白（OVA） 和滋養(yǎng)細胞膜抗原（TMA） 誘導小鼠妊娠免疫耐受效果的研究， 經(jīng)口服途徑給自然流產(chǎn)小鼠模型以適當劑量的抗原OVA 和TMA2 后，能有效誘導小鼠妊娠免疫耐受形成，降低小鼠的胚胎丟失率。國外近年來對卵清蛋白性質(zhì)和功能的研究很少。

三、本研究的目的和意義

盡管卵清蛋白占卵清中總蛋白的60-65%，它的功能卻仍然未知。盡管卵清蛋白的序列與抗胰蛋白酶和其它serpin家族的功能型抑制劑具有30%同源性，它卻沒有表現(xiàn)出任何的蛋白酶抑制劑活性。它的公認反應中心環(huán)的Ala-Ser鍵表現(xiàn)出對彈性蛋白酶的特異性，但是它僅僅是作為底物而不是抑制劑。

近來，卵清蛋白已成為研究影響蛋白變性、重折疊的因子的理想模型。其間，對非抑制性卵清蛋白向抑制性卵清蛋白轉(zhuǎn)變的研究可能對serpins的結(jié)構與功能間的關系提供重要證據(jù)。將卵清蛋白引入酵母中表達可以提高宿主的營養(yǎng)價值。以前關于將卵清蛋白引入真菌的嘗試有引入釀酒酵母。

卵清蛋白在卵中含量如此之高，不可能僅僅是作為孵化的營養(yǎng)物質(zhì)。關于它的不為人知的潛在功能，需要我們進一步的研究。另外，卵清蛋白屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，卻不具有抑制活性的原因，尚需要更深入的探討。

由于卵清中蛋白種類較多，不易純化。而畢赤酵母能夠高效表達外源蛋白，且分泌的內(nèi)源蛋白種類很少，背景蛋白影響小，易于純化和大量制備卵清蛋白高純度樣品，為揭示卵清蛋白結(jié)構與功能的關系奠定了基礎。