蘇少虎 李冉

摘 要：對新疆地區(qū)奶牛乳房炎（包括隱性乳房炎和臨床乳房炎）進行了發(fā)病率和致病菌進行了流行病學調查。結果發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)7個牧場隱性乳房炎發(fā)病率在11.3%～28.8%。大部分乳房炎發(fā)病為單一細菌感染引起。隱性乳房炎中共分離得到9個不同種屬的病原菌，以凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌和無乳鏈球菌為最常見。臨床乳房炎樣品中共分離得到11個不同種屬的樣品，流行度最高的四種病原菌為凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌。在隱性乳房炎和臨床乳房炎樣品中均分離得到了金黃色葡萄球菌。

關鍵詞：奶牛乳房炎；病原菌；流行病學

奶牛乳房炎（bovine mastitis）是乳房受到物理、化學、微生物等致病因子刺激所發(fā)生的一種紅、熱、腫、痛的炎性變化[1]。乳房炎是奶牛最常發(fā)的疾病之一，同時也是對奶牛場危害最大、導致奶牛業(yè)經濟損失最嚴重的疾病之一[2]。奶牛乳房炎最主要的病因是病原微生物感染乳腺組織，目前為止已發(fā)現(xiàn)的約150多種致病菌中，常見的有23種，包括球菌、桿菌、支原體、真菌或酵母菌、病毒等[3]。在所有的病原微生物中，細菌感染是最主要的。奶牛乳房炎分為臨床乳房炎和隱性乳房炎。臨床乳房炎的主要特點是乳汁發(fā)生肉眼可見變化，包括顏色發(fā)生改變，乳汁中有凝塊和絮狀沉淀等；或者乳房局部發(fā)生紅熱腫痛變化；或者奶牛本身發(fā)生了系統(tǒng)性變化包括食欲降低、發(fā)熱、精神萎靡等。隱性乳房炎僅表現(xiàn)出乳汁的體細胞數(shù)（SCC）升高和細菌培養(yǎng)陽性等。

實際上，弄清病原菌的類型對乳房炎的防控和治療具有非常重要的指導意義。在此基礎上，筆者對新疆地區(qū)的7 個地理位置不同的規(guī)模化奶牛場乳房炎發(fā)病情況進行流行病學調查，旨在揭示引起新疆地區(qū)奶牛臨床乳房炎和隱性乳房炎發(fā)病的主要病原菌分布情況，以期為牧場乳房炎防控與治療提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

CMT診斷液由北京奶牛中心提供；各種細菌生長培養(yǎng)基及選擇性鑒定培養(yǎng)基購自北京陸橋試劑司；生化編碼鑒定管GYZ-15e、TH-16S、鏈球菌屬生化編碼鑒定系統(tǒng)和鑒定相關配套試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司；細菌基因組提取試劑盒、PCR 反應聚合酶、DNA 分子Marker、瓊脂糖、PCR 膠回收試劑盒，均購自北京全式金生物公司。

1.2 采樣牛場

選擇新疆地區(qū)7個規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場，每個奶牛場隨機無菌收集乳區(qū)奶樣份80份，共560份冰盒中運送至實驗室進行細菌培養(yǎng)。根據(jù)牛場的發(fā)病情況，在抗生素治療前無菌收集臨床乳房炎樣品共81份，放在牛場冰箱中冷凍或冷藏，統(tǒng)一運送至實驗室進行細菌培養(yǎng)。

1.3 乳樣的采集及隱性乳房炎的檢測

清洗乳房后用紙巾擦干，棄掉前3把奶，用0.5%碘伏溶液進行乳頭藥浴30 s，再用無菌棉球將乳頭孔擦干并用75%酒精反復擦拭乳頭孔，風干后接取10～15 mL乳樣于無菌乳樣瓶中，整個采樣過程中嚴禁污染。返回實驗室后于每管中取2 mL乳樣置于診斷托盤上，在每個托盤中加入2 mL CMT隱性乳房炎診斷液，搖勻，30 s后觀察結果。隱性乳房炎根據(jù)反應現(xiàn)象和CMT隱性乳房炎診斷液判定標準（見表1）進行判斷，陽性以上（SCC>50萬/mL）判定為隱性乳房炎樣品。

1.4 乳房炎病原菌的分離和純化

吸取100 μL乳房炎奶汁，用接種環(huán)劃線接種于5%羊血TSA 培養(yǎng)基上，37℃溫箱培養(yǎng)24 h。在平板上判斷是否存在污染，如未污染，挑取單菌落再次劃線接種于5%羊血TSA培養(yǎng)基上，進行純化培養(yǎng)，觀察菌落大小、顏色、形狀及溶血狀況等。挑取純化培養(yǎng)的細菌單菌落進行革蘭染色，分為陽性桿菌、陰性桿菌、陽性球菌和陰性球菌。陽性球菌進行觸酶試驗，陽性者進行凝固酶試驗并接種至7.5%氯化鈉甘露醇培養(yǎng)基。陰性桿菌接種于麥康凱培養(yǎng)基和SS培養(yǎng)基上，陽性桿菌和陰性球菌視情況進行細菌的測序鑒定。

1.5 乳房炎病原菌的鑒定

1.5.1 生化鑒定

觸酶陽性且在7.5%氯化鈉甘露醇培養(yǎng)基生長的細菌用葡萄球菌編碼系統(tǒng)鑒定；將觸酶試驗陰性的細菌接種至鏈球菌生化編碼鑒定系統(tǒng)。取在麥康凱培養(yǎng)基上生長并變色的革蘭陰性桿菌接種至腸桿菌科生化編碼鑒定系統(tǒng)，培養(yǎng)24 h 后觀察結果，根據(jù)各種鑒定管的顏色變化進行編碼鑒定。

1.5.2 16S rRNA基因測序鑒定

對于生長性狀較復雜和革蘭染色結果較特殊、不能通過生化鑒定方法鑒別的菌株進行測序鑒定。具體操作方法如下：將單個菌株接種于增菌肉湯中，37℃振蕩過夜培養(yǎng)； 離心，用細菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，用Premier軟件設計16Sr RNA基因的通用引物rDNA-1（5'-GAGATTGATCTGGACCAG-3'）和rDNA-2（5'- TAGCTGGTTACGACAT-3'），經過Blast比對，確定其通用性。設定并摸索合適的PCR反應體系以得到清晰的單一條帶用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，如果在1 500 bp 處有清晰條帶，且無特異性條帶，可以進行PCR 產物的純化測序。測序結果通過Blast數(shù)據(jù)庫比對，對細菌種屬進行精確判定。

2 結果

2.1 隱性乳房炎發(fā)病率

由表2看出，新疆地區(qū)牛場中隱性乳房炎的發(fā)病率在11.3%～28.8%之間，各牛場的隱性乳房炎發(fā)病率差異明顯，平均發(fā)病率為21.4%。

2.2 細菌培養(yǎng)情況

120份隱性乳房炎樣品接種到平板上，有102份呈現(xiàn)陽性生長，細菌培養(yǎng)陽性率為85%。其中有91份樣品為單一細菌生長，8份樣品有兩種細菌生長；3份樣品有三種及以上細菌生長，污染率為3%。81份臨床乳房炎樣品中，有65份呈現(xiàn)陽性生長，細菌陽性培養(yǎng)率為80%；其中53份樣品為單一細菌生長，6份樣品為兩種細菌生長；6份樣品為三種及以上細菌生長，污染率為7%。

2.3 細菌測序鑒定結果

由圖1可見，不同種屬的病原菌均可通過16S rRNA基因的序列測定，擴增出約1 600 bp的片段。

2.4 乳房炎病原菌種類

經過生化鑒定和測序鑒定相結合的方法，共分離鑒定得到隱性乳房炎病原菌107株，分為9個不同種屬（圖2），其中最多的三種隱性乳房炎病原菌依次為凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌和無乳鏈球菌。臨床乳房炎病原菌65株，分為11個不同種屬（圖3），其中最多的四種病原菌依次為凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌。

3 討論

3.1 乳房炎發(fā)病率

試驗結果表明，新疆地區(qū)的隱性乳房炎發(fā)病率為21.4%，各牛場之間的發(fā)病率存在較大的差異，這是由于衛(wèi)生狀況和管理措施存在差異造成的。單志貴、蕭乾慶、楊章平和雙金等報道的隱性乳房炎乳區(qū)發(fā)病率分別為59.1%、31.9%、28.0%和32.28%[3-6]，均高于本調查顯示的結果，說明可能隨著環(huán)境衛(wèi)生、擠奶操作的提升，在我國隱性乳房炎的發(fā)病率存在著一定程度的降低。實際上，正確的擠奶操作流程，良好的擠奶設備維護和優(yōu)質的臥床墊料管理，對降低乳房炎的發(fā)病率至關重要。乳房炎的樣品中大部分細菌培養(yǎng)為陽性，但是也有少部分未培養(yǎng)出細菌，分析原因有以下幾點：引起乳房炎的病原微生物不能通過普通培養(yǎng)基培養(yǎng)出來，比如支原體和部分真菌；細菌量太低導致使用普通微生物培養(yǎng)法難以保證高靈敏度；部分由金葡菌感染的病例，細菌可能進入到中性粒細胞內導致無法檢測出；臨床乳房炎是由革蘭氏陰性桿菌引起，病例發(fā)現(xiàn)較晚，在檢測時細菌已經被乳房內的炎癥細胞殺滅。因此，盡管病原微生物培養(yǎng)有時為陰性，但這類乳房炎病例仍然不能被忽視。同時調查結果發(fā)現(xiàn)，大部分乳房炎樣品中分離得到了單一類型的病原菌，說明無論是隱性乳房炎還是臨床乳房炎，其發(fā)病主要是由單一種屬細菌感染引起的，同時也說明本試驗的無菌采樣工作較好，出現(xiàn)乳樣污染的情況較少。

3.2 乳房炎病原菌流行情況

通過本次流行病學調查可知，在新疆地區(qū)引起隱性乳房炎最主要的致病菌為凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌和無乳鏈球菌；引起臨床乳房炎的病原菌主要為凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌。中國農業(yè)科學院中獸醫(yī)研究所在上世紀80年代對西北、華北、東北、華南地區(qū)22個城市32個奶牛場的一萬余頭成年泌乳牛進行了臨床型乳房炎病因及發(fā)病情況調查[7]，我們的最主要病原菌分離結果與其具有一定的差異，說明我國乳房炎的菌群結構發(fā)生了較大的變化。

3.3 主要病原菌流行原因分析

凝固酶陰性葡萄球菌是一種條件致病菌，盡管在我國的乳房炎防治中還未引起相應的關注，但外國乳房炎研究者對其引起的乳房炎進行了細致、系統(tǒng)的報道[8-10]，并表明由這類病原菌引起的乳房炎發(fā)病正處于上升趨勢；我們的調查結果呼應了這方面報道：應該對凝固酶陰性葡萄球菌性乳房炎進行詳細地研究，并在臨床防治上給予高度的重視。無乳鏈球菌主要寄存于患病的乳腺組織中，通過不規(guī)范的擠奶操作和管理不當在牛群中進行傳播。引起的乳房炎具有高傳染性。在本部分研究中，無乳鏈球菌引起乳房炎的比例也較高，提醒我們目前在國內的牛場中，廣泛存在著擠奶操作不規(guī)范、管理混亂等問題，這些都是需要研究者結合臨床獸醫(yī)及管理者，共同面對、解決的。大腸桿菌作為一種環(huán)境性致病菌，與牛場的環(huán)境衛(wèi)生關系最大，同時大腸桿菌性乳房炎可能因為其內毒素的釋放引起全身性的敗血癥，應該引起臨床獸醫(yī)的重視，在治療時采用非甾體抗炎藥結合抗生素的治療方式，可提高治療效果?！觯ň庉嫞旱一郏?/p>

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