沈濤 賈琳 楊亞麗 張亞

摘 要 薯蕷屬植物（Dioscorea L.）多數(shù)種類可供藥用和食用，具有重要的經(jīng)濟價值，其礦質(zhì)元素含量變化對薯蕷資源的評價和安全食用具有重要意義。本研究以產(chǎn)自云南的參薯（D. alata L.）、薯蕷（D. opposita Thunb.）、日本薯蕷（D. japonica Thunb.）、毛膠薯蕷（D. subcalva Prain et Burkill）、云南薯蕷（D. yunnanensis Prain et Burkill）和高山薯蕷（D. henryi（Prain et Burkill）C. T. Ting）為研究對象，采用火焰原子吸收分光光度法（FAAS）和原子熒光分光光度法（AFS）分別測定這6種薯蕷屬植物地下塊莖中11種礦質(zhì)元素的含量并構建元素指紋圖譜。結果表明：Pearson相關系數(shù)和夾角余弦均可用于薯蕷元素指紋圖譜的相似性分析；Fe和Mg是6種薯蕷中的主要礦質(zhì)元素；Cu、Zn、Mn、Na和K的絕對含量介于1～100 mg/kg之間，為薯蕷中的累積微量元素；As和Cd的絕對含量低于1 mg/kg，為薯蕷中的痕量元素；Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、Na和K的百分含量對不同薯蕷樣品間元素指紋圖譜的差異性影響最大。研究結果為薯蕷屬植物資源的評價和安全食用提供科學依據(jù)。

關鍵詞 薯蕷；礦質(zhì)元素；指紋圖譜；多變量分析；資源評價

中圖分類號 S632.1 文獻標識碼 A

指紋圖譜技術常用于食品、藥品的質(zhì)量控制及產(chǎn)地溯源[1-2]。目前應用于植物資源評價的指紋圖譜技術主要針對有機化合物[3-4]；咖啡、小麥、水稻等物種的研究表明礦質(zhì)元素及其含量可用于構建指紋圖譜，輔助植物資源的評價研究[5-8]。周應群等[9]采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測定不同生產(chǎn)方式的甘草中16種礦質(zhì)元素含量，通過指紋圖譜分析，揭示礦質(zhì)元素在不同甘草類型間的差異規(guī)律。Zheng等[10]測定中國21種藥用植物中Li、Mn、Ni等8種元素含量，進行藥材礦質(zhì)元素指紋圖譜相似性分析，建立了藥材質(zhì)量控制的新方法。近年對杭白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）、 夏枯草（Prunella vulgaris L.）、鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）等物種的研究報道表明，礦質(zhì)元素含量對藥食同源植物的資源評價和開發(fā)利用具有重要意義[11-13]。

薯蕷屬植物（Dioscorea L.）廣泛分布于熱帶及溫帶地區(qū)，中國西南和東南部是其主要產(chǎn)區(qū)[14]。中國薯蕷資源豐富，多數(shù)種類可供藥用和食用，具有重要的經(jīng)濟價值。參薯（D. alata L.）、薯蕷（D. opposita Thunb.）、 日本薯蕷（D. japonica Thunb.）等在中國廣泛栽培[14]。其中，薯蕷具補脾養(yǎng)胃、生津益肺等功效，被《中國藥典》2010版收錄作為傳統(tǒng)中藥——山藥的植物來源[15]。目前中國薯蕷屬植物資源評價研究主要集中于形態(tài)特征、分子系統(tǒng)學和化學成分含量[16-18]，關于薯蕷不同物種間礦質(zhì)元素指紋圖譜研究尚未見報道。本研究以產(chǎn)自云南的參薯、薯蕷、日本薯蕷等6種薯蕷為研究對象，采用火焰原子吸收分光光度法（FAAS）和原子熒光分光光度法（AFS）測定不同薯蕷地下塊莖中Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、As、Cd、Na和K等元素含量并構建元素指紋圖譜，結合多變量分析展開薯蕷中礦質(zhì)元素的評價研究。研究結果以期為薯蕷屬植物資源的評價和安全食用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 樣品信息見表1。參薯、薯蕷、日本薯蕷、毛膠薯蕷、云南薯蕷和高山薯蕷樣品采集時間為2013年9月中旬至10月初，采集部位為植株地下塊莖。云南薯蕷、毛膠薯蕷、高山薯蕷為野生樣品，其余薯蕷均為栽培樣品。樣品共計10批（S 01～S 10），采集地涉及云南滇中的玉溪市，滇西北的大理州和麗江市，滇東的曲靖市。每批測定樣品均為10株個體的混樣。鮮樣采集后帶回實驗室，用去離子水洗凈根部泥土，切片并放入60 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎過100目尼龍篩，放入自封袋中避光保存

1.1.2 儀器和試劑 （1）儀器：火焰原子吸收分光光度計（TAS-990，北京普析通用儀器有限責任公司）；原子熒光分光光度計（AFS-3100，北京海光儀器有限公司）；萬分之一分析天平（AR1140，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；控溫電爐（DDL-4x1KW，金壇市金城國勝實驗儀器廠）；高溫馬弗爐（SRJX-8-13，北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；Millipore純水系統(tǒng)（Milli-Q Academic，美國Millipore）。

（2）試劑：測定礦質(zhì)元素Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、As、Cd、Na、K所用標準溶液均購自濟南眾標科技有限公司；硝酸和鹽酸為優(yōu)級純，購自西隴化工股份有限公司；高氯酸（優(yōu)級純）和硫脲（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司；去離子水用美國Millipore純水系統(tǒng)自制。

1.2 方法

1.2.1 樣品消解 （1）Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、Cd、Na和K消解方法：稱取樣品4.000 g置于250 mL錐形瓶中，加入30 mL體積比為5 ∶ 1的硝酸-高氯酸混合液，置于控溫電爐上加熱，待樣品不再產(chǎn)生棕色氣體時升高電爐溫度，待瓶內(nèi)溶液體積為1 mL時取下冷卻，將溶液轉(zhuǎn)移至比色管中，用去離子水定容至50 mL，搖勻備用，同時做空白實驗。

（2）總砷（As）消解方法：稱取樣品2.000 g于50 mL瓷坩堝中，于電爐上碳化至無煙，移入550 ℃高溫馬弗爐中灰化4 h，冷卻后加入10 mL體積比為1 ∶ 1的鹽酸-水溶液溶解灰分，轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，加入2.5 mL硫脲溶液，用體積比為1 ∶ 9的硫酸-水溶液定容至25 mL，搖勻備用，同時做空白實驗。

1.2.2 元素含量測定 待測樣品中Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、Cd、Na和K含量測定采用火焰原子吸收分光光度法（FAAS）。Cu含量測定參照GBT5009.13-2003；Zn含量測定參照GBT5009.14-2003；Pb含量測定參照GB 5009.12-2010的方法；Ni含量測定參照GBT5009.138-2003；Mg、Fe、Mn含量測定參照GB/T12396-2003的方法；Cd含量測定參照GB/T5009.15-2003；Na和K含量測定參照GB/T5009.91-2003；As含量測定采用原子熒光分光光度法（AFS），參照GB/T5009.11-2003。

1.2.3 回歸方程 用硝酸和去離子水配置質(zhì)量分數(shù)為2%的稀硝酸，將其作為11種礦質(zhì)元素標準溶液的稀釋劑。分別取適量Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、As、Cd、Na和K的儲備液，用稀釋劑配制不同濃度的標準溶液。以吸光度A對濃度c（μg/50 mL）作回歸方程，r2值、線性范圍和檢出限見表2。

1.3 數(shù)據(jù)分析

依據(jù)礦質(zhì)元素含量測定結果建立1個n×p的數(shù)據(jù)矩陣用于指紋圖譜分析[19]，其中n=10，代表不同產(chǎn)地10批薯蕷樣品；p=11，代表用于構建薯蕷樣品指紋圖譜的11種礦質(zhì)元素含量信息。數(shù)據(jù)矩陣具體表示如下：

Xi和Yi為2個指紋圖譜間的元素含量，和 為元素平均值。m為元素的個數(shù)。

聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）用于不同產(chǎn)地薯蕷屬植物礦質(zhì)元素含量的分類與描述；主成分分析（Principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）及變量投影重要性準則（Variable importance for the projection，VIP）用于篩選特征元素和導致樣品間差異的主要元素變量。相似性分析、聚類分析和主成分分析用軟件SPSS 19.0完成，偏最小二乘法及變量投影重要性準則用軟件SIMC-P 11.5完成。

2 結果與分析

2.1 加標回收率

為考察方法的可靠性，精密稱取已知含量樣品（S 02）6份，分別加入適量標準溶液，依照1.2.1的方法制成供試溶液，進行6次加標平行測定，計算加標回收率和相對標準偏差（RSD%）。表3顯示11種元素加標回收率在94.75%～101.80%之間，RSD數(shù)值介于1.10%～4.98%之間，方法穩(wěn)定可靠。

2.2 薯蕷礦質(zhì)元素指紋圖譜的建立

6種薯蕷屬植物中礦質(zhì)元素絕對含量測定結果見表4，所有樣品中均含有Cu、Zn、Pb等11種礦質(zhì)元素，11種礦質(zhì)元素在6種薯蕷屬植物根莖中平均含量由大到小為：Fe> Mg> Na> Zn> K> Cu> Mn> Ni> Pb> Cd> As。不同樣品間，As絕對含量變化最大，最大值為最小值的55.13倍；其次為Fe、Ni和Mn，最大值分別為最小值的31.51、25.83、20.77倍；K，Cu和Zn含量變化較小，最大值分別為最小值的1.79、2.34、3.38倍。

以礦質(zhì)元素百分含量為變量，研究6種薯蕷屬植物中礦質(zhì)元素構成變化（圖1）。結果顯示，F(xiàn)e元素含量占11種礦質(zhì)元素總含量的25.72%至89.86%。云南薯蕷和日本薯蕷中Mg元素百分含量均低于6.00%，其余樣品均高于19.00%。As元素百分含量在所有元素中最低，除樣品S 06和S 07外，其余樣品百分含量均低于0.01%。Cd百分含量介于0.02%至0.69%之間，Pb元素百分含量介于0.06%至0.66%之間；大部分樣品Ni元素均低于1.00%；以上3種元素在薯蕷屬植物中的構成比例均處較低水平。Na和Cu在高山薯蕷中百分含量最高（分別為10.65%和4.39%），Mn元素在采集自玉溪的參薯中百分含量最高（10.88%），高山薯蕷中Cu、Zn、Pb、Mg、Mn、Cd和Na百分含量在所有樣品中均處較低水平。

2.3 相似性分析與聚類分析

相似性分析用于研究不同薯蕷樣品礦質(zhì)元素指紋圖譜的相似性，Pearson相關系數(shù)顯示（表5）：S 01：S 02，S 01：S 05，S 01：S 06，S 01：S 07，S 01：S 08，S 01：S 09的Pearson系數(shù)均大于0.900；S 01：S 04的Pearson相關系數(shù)為0.723；S 01：S 03與S 01：S 10的Pearson相關系數(shù)較接近，分別為0.551和0.565。夾角余弦法亦得到類似的結果（表6）。以各元素絕對含量及百分含量為變量進行聚類分析，結果顯示聚類分析與相似性分析結果一致（圖2），相互支持。結合以上分析結果可知，10批薯蕷樣品可分成3類，S 01、S 02、S 05、S 06、S 07、S 08和S 09的礦質(zhì)元素含量及構成較接近，可歸為第一類；樣品S 03與S 10可歸為第二類；樣品S 04單獨歸為第三類。

2.4 薯蕷類礦質(zhì)特征元素和樣品間主要元素變量的篩選

采用主成分分析對數(shù)據(jù)進行標準化處理，并對樣品中的特征礦質(zhì)元素進行研究。由表7可知前4個主成分累計貢獻率達84.47%。第一主成分特征值為10.36，代表礦質(zhì)元素在植物中的構成比例，包括Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Mn、Na和K的百分含量信息；第二主成分特征值為3.80，主要為Ni、Fe、Mn和As的含量信息；第三主成分特征值為2.49，主要反映Zn、Pb、Mg和Cd的含量信息；第四主成分特征值為1.92，反映As在植物中的元素含量構成信息。50%以上總方差來自前4個主成份，因此Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、As、Cd、Na和K為6種薯蕷屬植物的特征元素。

為進一步明確不同特征元素對樣品間元素指紋圖譜差異性貢獻的大小，采用偏最小二乘法分析，計算變量VIP數(shù)值，結果顯示（圖3）Mg、Pb、As、Mn、Fe、Na的絕對含量與Mg、Fe、Cu、K、Zn的百分含量的VIP數(shù)值均大于1，以上變量對不同薯蕷樣品間元素指紋圖譜的差異性影響最大。

3 討論與結論

3.1 礦質(zhì)元素指紋圖譜結合多變量分析可對樣品指紋圖譜信息進行定量評價和分類描述

Pearson相關系數(shù)和夾角余弦均可用于薯蕷樣品元素指紋圖譜的相似性分析。所有樣品依據(jù)Mg、Pb、As、Mn、Fe、Na的絕對含量與Mg、Fe、Cu、K、Zn的百分含量可分為3類。第一類包括薯蕷、參薯和高山薯蕷，其塊莖中Mg、Cu、Zn和K構成比例較高是該類薯蕷的主要特征元素。第二類植株塊莖中Fe和As含量較高，包括云南薯蕷和日本薯蕷。第三類即毛膠薯蕷植株塊莖中Fe、Mn、As含量均明顯高于其它薯蕷。同屬植物盾葉薯蕷（D. zingiberensis）和穿龍薯蕷（D. nipponica）塊莖中礦質(zhì)元屬的積累變化研究表明，薯蕷塊莖中富集特定元素，對K、Zn、Fe等元素的吸收量大于農(nóng)作物，且元素含量與土壤中礦質(zhì)元素含量相關性不顯著[20-21]。本研究顯示，相同產(chǎn)地的薯蕷樣品并未完全聚為一類，6種薯蕷屬植物礦質(zhì)元素指紋圖譜的相似性受物種的影響較大。

3.2 不同礦質(zhì)元素在薯蕷屬植物塊莖中的累積呈現(xiàn)不同規(guī)律

李鳳霞等[22]測定了199種中藥中41種元素含量，本研究結果與該文獻報道對比發(fā)現(xiàn)，參薯、薯蕷、日本薯蕷、毛膠薯蕷、云南薯蕷和高山薯蕷中Cu、Zn和Pb的元素含量與199種中藥的平均含量較接近，毛膠薯蕷與云南薯蕷的Fe含量高于199種中藥的平均值，其余薯蕷樣品Fe、Mg、Mn、As和K的含量均低于其平均值，產(chǎn)自云南玉溪的薯蕷和參薯的Ni含量高于199種中藥的平均值，產(chǎn)自云南麗江和大理的薯蕷與產(chǎn)自玉溪的云南薯蕷、毛膠薯蕷、高山薯蕷Ni含量則低于其平均值。以上對比結果表明毛膠薯蕷與云南薯蕷對Fe元素的需求量較其它藥用植物大，而Ni元素在薯蕷塊莖中的積累可能受產(chǎn)地和植物吸收特性的共同影響。

3.3 薯蕷屬植物塊莖中礦質(zhì)元素計量特征

Fe和Mg是6種薯蕷中的主要礦質(zhì)元素，其中Fe元素在日本薯蕷、云南薯蕷和毛膠薯蕷中的絕對含量均大于1 000 mg/kg，為薯蕷屬植物的主要累積元素。同為根莖類藥材的葛根和人參，其Fe、Mg含量亦較其它元素高[23-24]，與薯蕷塊莖的研究結果類似。大部分薯蕷樣品中Cu、Zn、Mn、Na和K絕對含量介于1 mg/kg至100 mg/kg之間，為薯蕷中的累積微量元素。除產(chǎn)自云南曲靖的薯蕷，其余樣品As和Cd的絕對含量均低于1 mg/kg，為薯蕷屬植物中的痕量元素。作為一類藥食同源植物，薯蕷塊莖中As、Cd含量符合世界衛(wèi)生組織公布的限量標準[25]。本研究為云南薯蕷屬藥用和食用植物資源的評價和安全利用提供科學依據(jù)。

參考文獻

[1] Duan B， Huang L， Chen S. Chemical fingerprint analysis of Fritillaria delavayi Franch. by high-performance liquid chromat-

ography[J]. J Sep Sci， 2012， 35（4）： 513-518.

[2] Deng J W， Fan C L， Jiang Z J， et al. Quality assessment and origin tracing of Guangdong Liangcha granules using direct mass spectrometry fingerprinting[J]. Anal Methods， 2012， 4（11）： 3 638-3 645.

[3] Chen F， Luo J， Kong L. Determination of 10 ginsenosides in Panax ginseng of different harvest times based on HPLC fingerprints and principal component analysis[J]. Nat Prod Res， 2013， 27（9）： 851-854.

[4] Zhang R， Chen J， Shi Q， et al. Quality control method for commercially available wild Jujube leaf tea based on HPLC characteristic fingerprint analysis of flavonoid compounds[J]. J Sep Sci， 2014， 37（1-2）： 45-52.

[5] Anderson K A， Smith B W. Chemical profiling to differentiate geographic growing origins of coffee[J]. J Agr Food Chem， 2002， 50（7）： 2 068-2 075.

[6] Laursen K H， Schjoerring J K， Olesen J E， et al. Multielemental fingerprinting as a tool for authentication of organic wheat， barley， faba bean， and potato[J]. J Agr Food Chem， 2011， 59（9）： 4 385-4 396.

[7] Podio N S， Baroni M V， Badini R G， et al. Elemental and isotopic fingerprint of argentinean wheat. matching soil， water， and crop composition to differentiate provenance[J]. J Agr Food Chem， 2013， 61（16）： 3 763-3 773.

[8] Cheajesadagul P， Arnaudguilhem C， Shiowatana J， et al. Discrimination of geographical origin of rice based on multi-element fingerprinting by high resolution inductively coupled plasma mass spectrometry[J]. Food Chem， 2013， 141（4）： 3 504-3 509.

[9] 周應群， 余 華， 李 瀅， 等. 基于無機元素特征的甘草藥材分型研究[J]. 光譜學與光譜分析， 2010， 30（4）： 1 101-1 104.

[10] Zheng Y J， Zheng K， Liu E D， et al. Elemental fingerprint of herbal medicines formed by inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy（ICP-AES）[J]. JESTEC， 2013， 6（1）： 111-114.

[11] 諸 燕， 苑 鶴， 李國棟， 等. 鐵皮石斛中11種金屬元素含量的研究[J]. 中國中藥雜志， 2011， 36（3）： 356-360.

[12] 陳宇航， 郭巧生， 劉 麗， 等. 栽培與野生夏枯草礦質(zhì)元素含量及分布特征研究[J]. 中國中藥雜志， 2011， 36（22）： 3 070-3 074.

[13] 張 龍， 曲愛麗， 蔣 晗， 等. 基于礦質(zhì)元素檢測的杭白菊原產(chǎn)地溯源技術研究[J]. 核農(nóng)學報， 2013， 27（10）： 1 553-1 559.

[14] 錢嘯虎， 徐 垠， 胡之壁， 等. 中國植物志（第16卷第1冊）[M]. 北京： 科學出版社， 1985： 54.

[15] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典一部[S]. 北京： 化學工業(yè)出版社， 2010.

[16] 黃玉仙， 王豐青， 杜家方， 等. 薯蕷屬植物種質(zhì)資源形態(tài)變異的數(shù)量分析[J] 中國中藥雜志， 2013， 38（3）： 318-324.

[17] 吳志剛， 李小俠， 范傳穎， 等. 相關系列擴增多態(tài)性分子標記分析部分山藥品種遺傳多樣性[J]. 中國藥學雜志， 2013， 48（9）： 681-686.

[18] 張新新， 梁晉如， 趙 曄， 等. 盾葉薯蕷藥材甾體總皂苷成分HPLC-ELSD指紋圖譜的研究[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（19）： 3 313-3 318.

[19] Mahmood N， Petraco N， He Y. Elemental fingerprint profile of beer samples constructed using 14 elements determined by inductively coupled plasma-mass spectrometry（ICP-MS）： multivariation analysis and potential application to forensic sample comparison[J]. Anal Bioanal Chem， 2012， 402（2）： 861-869.

[20] 李向民， 李軍超， 陳 剛， 等. 盾葉薯蕷元素組成特點及其與土壤營養(yǎng)元素的關系研究[J]. 西北植物學報， 2005， 25（3）： 531-535.

[21] 尹海波， 張 囡， 康廷國. 穿龍薯蕷藥材和土壤無機元素的相關性分析[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（19）： 137-141.

[22] 李鳳霞， 歐陽荔， 劉亞瓊， 等. 466份中藥材無機元素測定及結果分析[J]. 中國中藥雜志， 2011， 36（21）： 2 994-3 000.

[23] 張 敏， 卜曉英， 唐純翼， 等. 葛根中微量元素的光譜測定[J]. 理化檢驗（化學分冊）， 2005， 41（7）： 473-474.

[24] 張建逵， 康廷國， 竇德強. 林下山參與園參無機元素的聚類分析和主成分分析[J]. 中草藥， 2012， 43（9）： 1 835-1 840.

[25] World Health Organization. ISBN 9789241594448 WHO guidelines for assessing quality of herbal medicines with reference to contaminants and residues[S]. 2007.

責任編輯：林海妹