孫蓮 孟磊 阿布都許庫爾.吐爾遜

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)教研室，新疆烏魯木齊 830054）お

摘要 ［目的］建立測定桑枝多糖中單糖的組成及含量的方法。［方法］水提醇沉法提取桑枝多糖，CF3COOH水解多糖，水解產(chǎn)物用鹽酸羥胺、吡啶和醋酸酐衍生化，生成糖腈乙酸酯衍生物，氣相色譜法測定桑枝多糖的單糖組成及含量。［結(jié)果］新疆桑枝多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等組成，含量分別為鼠李糖（11.8 mg/ml）、阿拉伯糖（14.4 mg/ml）、木糖（1.6 mg/ml）、甘露糖（1.9 mg/ml）、葡萄糖（22.3 mg/ml）及半乳糖（28.0 mg/ml）。［結(jié)論］該方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確可靠，可用于桑枝多糖中單糖的組成及含量┎舛?。?/p>

關(guān)鍵詞 桑枝；多糖；氣相色譜法

中圖分類號(hào) SB567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2014）19-06207-02

Determination of the Components and Contents of monosaccharides in Polysaccharide of Ramulus Mori from Xinjian by Gas Chromatography

SUN Lian et al

(College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830054)

Abstract ［Objective］ To establish a method for determining components and contents of monosaccharides in polysaccharides of Ramulus Mori. ［Method］ The polysaccharide was extracted by water and precipitated by alcohol, the polysaccharide was hydrolyzed by CF3COOH. Hydrolyzate was derivatized with hydroxylamine hydrochloride, pyridine and acetic anhydride and sugar nitrile acetate derivatives were produced. The composition and content of monosaccharide of polysaccharides of Ramulus Mori were determined by GC. ［Result］ The polysaccharides of Ramulus Mori were composed of rhamnose, arabinose, xylose, mannose, glucose, galactose. The contents were rhamnose (11.8 mg/ml), arabinose (14.4 mg/ml), xylose (1.6 mg/ml), mannose (1.9 mg/ml), glucose (22.3 mg/ml) and galactose (28.0 mg/ml) respectively. ［Conclusion］ The method is simple, sensitive and accurate. It can be used to determine the contents and components of monosaccharides in polysaccharide of Ramulus Mori.

Key words Ramulus Mori; Polysaccharide; GC

基金項(xiàng)目 新疆維吾爾自治區(qū)自然基金（2013211A055）。

作者簡介 孫蓮（1961- ），女，江蘇南京人，教授，碩士，從事藥物成分分析研究。

收稿日期 20140528

桑枝（RAMULUS MORI）是桑科桑屬植物桑（玀orus alba L.）的一年生干燥嫩枝，是中醫(yī)常用的傳統(tǒng)藥材，具有祛風(fēng)活絡(luò)、通利關(guān)節(jié)和燥濕利水之功效［1］。桑枝中的主要功效成分為多糖、黃酮類和生物堿類。現(xiàn)代藥理研究證明，桑枝多糖具有抗炎、抗氧化、抗衰老、防癌、抗?jié)儭⒔獐d、抗菌、提高機(jī)體免疫功能以及降糖降脂等多種功能［2-8］。測定桑枝多糖中單糖的組成及含量對桑枝的開發(fā)利用及藥效學(xué)研究十分必要。筆者利用氣相色譜法對桑枝多糖的組成及含量進(jìn)行測定［10］，以期為新疆桑枝的質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。桑枝，采自新疆喀什，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物教研室帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為桑的干燥嫩枝。

1.1.2 主要儀器。GC2010 Plus氫火焰離子化檢測器，購自島津公司。

1.1.3 主要試劑。鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖，均為生化試劑，購自成都科龍化工試劑廠；CF3COOH、醋酸酐、鹽酸羥胺、吡啶和氯仿均為分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件。色譜柱為RTX瞁AX 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；檢 測 器 為 FID；程序升溫為155 ℃（保持1 min），以0.4 ℃/min升至160 ℃（保持2 min），再以0.5 ℃/min升至169 ℃，以0.2 ℃/min的升溫速率升高到172 ℃；進(jìn)樣溫度為235 ℃；檢測器溫度為280 ℃；分流比10∶1，載氣為高純N2，進(jìn)樣量 10.0 μl。

1.2.2 桑枝多糖的提取。稱干燥至恒重并過60目篩的桑枝粉100.00 g，加適量的水，95 ℃時(shí)超聲提取30 min，過濾，濾渣再提取30 min，合并濾液，將濾液濃縮至100 ml，加濃度95%乙醇至含醇量達(dá)85%，4 ℃時(shí)靜置過夜，離心分離，得粗多糖。于上述粗多糖溶液中加入2%木瓜蛋白酶，60 ℃時(shí)酶解2 h，再用Sevag法（氯仿∶正丁醇=4∶1）除蛋白12次；H2O2脫色，醇沉并離心分離；沉淀物自然干燥，得淡黃色的桑枝┒嗵恰＊

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化。精密稱取鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)單糖各10.0 mg于具塞試管中，加入10.0 mg的鹽酸羥胺及0.5 ml的吡啶，混勻后封管，于95 ℃水浴中反應(yīng)30 min，取出冷至室溫，再于其中加乙酸酐 0.5 ml，搖勻后封管，于95 ℃水浴中反應(yīng)30 min，待乙?；磻?yīng)完成后，70 ℃水浴中用N2將產(chǎn)物吹干，用氯仿5.0 ml溶解殘?jiān)M(jìn)樣1.0 μl。

1.2.4 桑枝多糖的水解和衍生化。精密稱取桑枝多糖10.0 mg于具塞試管中，加入4.0 mol/L CF3COOH 1.0 ml，搖勻，110 ℃水浴中水解12 h，于70 ℃水浴用N2將產(chǎn)物吹干，按“1.2.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生化的方法將水解產(chǎn)物衍生化，進(jìn)樣1.0 μl。

1.2.5 方法學(xué)考察。（1）系統(tǒng)性試驗(yàn)。取適量對照品溶液和供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。（2）線性關(guān)系的考察。分別精密吸取衍生化后的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml于6個(gè)10 ml的容量瓶中，用氯仿稀釋至刻度，配成一系列質(zhì)量濃度不同的混合標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)樣，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（玐）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算各個(gè)單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)。（3）精密度試驗(yàn)。取同一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積，計(jì)算各單糖峰面積的玆SD。（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。吸取同一供試品溶液，在0、2、4、8、12 h各進(jìn)樣1次，記錄峰面積，計(jì)算各單糖含量的玆SD。（5）重復(fù)性試驗(yàn)。取6份桑枝多糖，按“1.2.4”項(xiàng)下水解和衍生化多糖，測得其中各單糖含量的玆SD。（6）加樣回收試驗(yàn)。取9份桑枝多糖，3份留為本底，在其他的6份中加入一定量的各標(biāo)準(zhǔn)單糖，按“1.2.4”項(xiàng)下水解和衍生化多糖，測定峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率，各單糖的平均回收率和RSD（n=6）。

1.2.6 桑枝多糖中單糖的含量測定。根據(jù)保留時(shí)間及加標(biāo)峰增高法，可確定新疆桑枝多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖組成。將“1.2.4”項(xiàng)下制備的桑枝供試品溶液進(jìn)樣10.0 μl，測定其中各單糖的峰面積，由各單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出桑枝多糖中單糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察 （1）系統(tǒng)性試驗(yàn)。圖1表明，對照品溶液和供試品溶液圖譜在相同時(shí)間上有對應(yīng)的吸收峰，各峰間分離度良好，彼此無干擾，表明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。（2）線性關(guān)系的考察。由表1可知，在各自范圍內(nèi)，各單糖濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。（3）精密度試驗(yàn)。計(jì)算得各單糖峰面積的玆SD別為鼠李糖（1.2%）、阿拉伯糖（0.97%）、木糖（1.9%）、甘露糖（0.97%）、葡萄糖（2.4%）和半乳糖（1.1%），表明精密度良好。（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。計(jì)算得各單糖含量的玆SD分別為鼠李糖（1.2%）、阿拉伯糖（1.5%）、木糖（0.89%）、甘露糖（2.1%）、葡萄糖（1.2%）、半乳糖（2.9%），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。（5）重復(fù)性試驗(yàn)。計(jì)算得各單糖含量的玆SD分別為鼠李糖（1.2%）、阿拉伯糖（1.3%）、木糖（2.1%）、甘露糖（1.3%）、葡萄糖（1.7%）和半乳糖（2.8%），表明該方法重復(fù)性良好。（6）加樣回收試驗(yàn)。計(jì)算得各單糖的平均回收率（玭=6）（RSD）分別為鼠李糖101.3%（1.4%）、阿拉伯糖104.5%（1.1%）、木糖97.6%（2.9%）、甘露糖97.2%（2.1%）、葡萄糖101.5%（1.2%）及半乳糖103.3%（1.5%），表明該方法準(zhǔn)確，可靠，可用于桑枝多糖中單糖的組成及含量測定。

注：A為混合對照品（standard）；B為樣品（sample）。1為鼠李糖（Rhamnose）；2為阿拉伯糖（Arabinose）；3為木糖（Xylose）；4為甘露糖（Mannose）；5為葡萄糖（Glucose）；6為半乳糖（Galactose）。

圖1 GC圖譜

表1 各單糖的回歸曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

單糖 回歸曲線 線性范圍∥mg/ml 相關(guān)系數(shù)玆

鼠李糖 玒=35 284X-10 845 0.02~0.12 0.999 2

阿拉伯糖 Y=21 948X-13 126 0.02~0.12 0.999 6

木糖 Y=30 734X-12 691 0.02~0.12 0.999 3

甘露糖 Y=25 785X-11 420 0.02~0.12 0.999 4

葡萄糖 Y=28 583X-12 235 0.02~0.12 0.998 9

半乳糖 Y=31 673X-10 567 0.02~0.12 0.999 8

2.2 桑枝多糖中單糖的含量測定結(jié)果 根據(jù)保留時(shí)間及加標(biāo)峰增高法，可確定新疆桑枝多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖組成。由各單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出桑枝多糖中單糖的含量分別為鼠李糖（11.8 mg/ml）；阿拉伯糖（14.4 mg/ml）；木糖（1.6mg/ml）；甘露糖（1.9 ﹎g/ml）；葡萄糖（22.3 mg/ml）；半乳糖（28.0 mg/ml）。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)以濃度為4.0 mol/L的H2SO4、CCl3COOH、CF3COOH為水解液，以水解產(chǎn)物中的葡萄糖峰面積為參考指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)CF3COOH為水解液時(shí)，水解效果最好。同時(shí)，考察了不同濃度的CF3COOH（1.0、2.0、4.0、6.0 mol/L）水解桑枝多糖12 h，結(jié)果表明，4.0 mol/L CF3COOH水解桑糖枝多，葡萄糖峰面積最大，多糖水解的較徹底。以4.0 mol/L CF3COOH為水解液水解桑枝多糖2、4、6、8、10、12及24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水解2、4、6、8、10、12及24 h時(shí)，葡萄糖的峰面積分別為156 234、225 431、294 675、358 921、436 533、455 346及459 838，由此可見，水解12 h與24 h時(shí)，無多大區(qū)別，故試驗(yàn)選擇4.0 mol/L的CF3COOH水解桑糖枝多糖12 h。

試驗(yàn)以水提醇沉法提取桑枝多糖，CF3COOH水解多糖，水解產(chǎn)物用鹽酸羥胺、吡啶和醋酸酐衍生化，生成糖腈乙酸酯衍生物，氣相色譜法測定桑枝多糖的單糖組成及含量。結(jié)果表明，該方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確可靠，可用于桑枝多糖中單糖的組成及含量測定。

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