段艷波 蔣福宇 高品一 劉學(xué)貴

(沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110142)お

摘要

［目的］研究蘿卜清除DPPH自由基的活性。［方法］通過(guò)對(duì)蘿卜葉水提物、水提物不同極性部位萃取物、蘿卜中脂肪油類有效成分β補(bǔ)如藪冀行清除DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼）自由基活性測(cè)試，對(duì)蘿卜的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。［結(jié)果］以檸檬酸為對(duì)照其清除能力大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴?>二氯甲烷層>蘿卜葉水提物>β補(bǔ)如藪>石油醚層>檸檬酸。［結(jié)論］蘿卜具有較好的抗氧化能力。

關(guān)鍵詞 蘿卜葉水提取物；不同極性部位萃取物；β補(bǔ)如藪跡籇PPH自由基

中圖分類號(hào) SB188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2014）19-06155-02

お

Research on DPPH Free Radical Scavenging Activity of Radish

DUAN Yan瞓o, LIU Xue瞘ui et al

(College of Pharmaceutical and Biological Engineering, Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang, Liaoning 110142)

Abstract ［Objective］ To study DPPH free radical scavenging activity of radish. ［Method］ This paper clears testing DPPH (1,1瞕iphenyl3瞡itrophenylhydrazine) free radical scavenging activity of the different polarities of water extracts from Radish leaves and the compound of β瞫itostero by isolating from radish. ［Result］ Using citric acid as standard, the order of the scavenging ability is ethyl acetate layer > dichloromethane layer >radish leaf extract > sitosterol > petroleum ether layer> citric acid. ［Conclusion］ Radish has a good antioxidant capacity.

Key words Radish leaf extract; Different polar parts; β瞫itostero; DPPH free radical scavenging

お

作者簡(jiǎn)介

段艷波(1991-)，男，內(nèi)蒙古赤峰人，本科，專業(yè)：天然藥物化學(xué)。*通訊作者，副教授，博士，從事天然產(chǎn)物及其衍生物的活性和制備工藝研究。

收稿日期 20140606

蘿卜（玆aphanus sativus 獿.）又名菜菔、蘆菔、菜頭、雹突等，為十字花科蘿卜屬（玆aphanus）1年或2年生的草本植物，在我國(guó)具有悠久的食品和藥品的使用歷史［1］。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，蘿卜中的化學(xué)成分主要有生物堿、黃酮、三萜皂苷、脂肪油、揮發(fā)油、硫代葡萄糖苷酯、有機(jī)酸和多糖等［2-3］。蘿卜成熟的種子、根、葉中的有效成分均有很好的藥用價(jià)值。研究顯示，蘿卜具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、降壓、止咳化痰、止血、利尿和增加小腸的蠕動(dòng)等藥理作用［4-12］。蘿卜的產(chǎn)量大、種植栽培技術(shù)成熟，且容易貯存，是具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的藥食兩用植物。

DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼）自由基是合成的一種穩(wěn)定的氮中心的自由基，主要由于其3個(gè)苯環(huán)的共軛穩(wěn)定作用及空間障礙，導(dǎo)致氮原子電子不能與電子成對(duì)。清除DPPH自由基試驗(yàn)的原理為清除劑和DPPH自由基孤對(duì)電子配對(duì)，使紫色消失變?yōu)辄S色，在紫外517 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度變小，清除劑的清除能力越強(qiáng)吸光度越?。▓D1）。因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單并且容易控制反應(yīng)，所以清除DPPH自由基是現(xiàn)今抗氧化活性評(píng)價(jià)和篩選應(yīng)用最廣泛的方法之一［13-15］。筆者以檸檬酸為對(duì)照品，對(duì)蘿卜葉水提物、水提物不同極性部位萃取物、蘿卜中脂肪油類的有效成分β補(bǔ)如藪冀行清除DPPH自由基活性研究，對(duì)蘿卜的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為蘿卜抗氧化活性成分的跟蹤分離研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

圖1DPPH自由基結(jié)構(gòu)及作用原理

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1

研究對(duì)象。白蘿卜葉，產(chǎn)地遼寧省沈陽(yáng)市，經(jīng)鑒定為蘿卜（玆aphanus sativus 獿.）的新鮮葉。

1.1.2

主要儀器。RE5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，購(gòu)自上海亞榮有限公司；TD5102電子天平，購(gòu)自余姚市金諾天平儀器有限公司；GZX睤(Ⅲ)循環(huán)式真空水泵，購(gòu)自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV3系列紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海光譜達(dá)儀器有限公司；HZC超聲波清洗器，購(gòu)自福州志科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3

主要試劑。DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼），購(gòu)自TCI公司；檸檬酸，購(gòu)自天津是永大化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸，購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥化學(xué)試劑公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1

總提物及其不同極性部位萃取物的制備。將采集的蘿卜葉晾干，取干燥的蘿卜葉放入水浴鍋中，在20 ℃條件下水浴提取18 h，提取完畢，過(guò)濾，收集濾液。取濾液500 ml，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯1 000 ml，萃取3次，萃取完畢，旋蒸，揮干，制得,3個(gè)極性部位萃取物的浸膏，待用［16］。

1.2.2

DPPH自由基儲(chǔ)備液的配置。準(zhǔn)確稱取DPPH粉末置于15 ml EP管中，量取10 ml無(wú)水乙醇加入EP管中配置得到2 mmol/L的DPPH儲(chǔ)備液。取1 ml儲(chǔ)備液加9 ml無(wú)水乙醇置于15 ml EP管得到0.2 mmol/L的DPPH待用。

1.2.3

樣品儲(chǔ)備液及其濃度梯度的配置。準(zhǔn)確稱取樣品粉末（石油醚組分、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、蘿卜葉水提物、β補(bǔ)如藪?、拿仕幔? mg置于15 ml EP管中，量取10 ml濃度70%無(wú)水乙醇加入EP管中，配置得到0.5 mg/ml的樣品儲(chǔ)備液；再用濃度70%無(wú)水乙醇將7種樣品儲(chǔ)備液分別稀釋至質(zhì)量濃度梯度為1.0、5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 │蘥/ml，得到試驗(yàn)樣品。

1.2.4

DPPH自由基最大波長(zhǎng)的確定。對(duì)0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液在350~800 nm范圍進(jìn)行波長(zhǎng)掃描［17-18］，考察最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.5

DPPH自由基穩(wěn)定性試驗(yàn)。用0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液與0.04 mmol/L的抗壞血酸混合，在波長(zhǎng)517 nm處監(jiān)測(cè)其吸光度，每隔2 min記錄1次，建立吸光度(玒)與時(shí)間(X)的關(guān)系。お

1.2.6

清除DPPH自由基試驗(yàn)。配置蘿卜葉不同極性段樣品質(zhì)量濃度梯度（1.0、5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 μg/ml）和0.2 mmol/L的DPPH。樣品組：用移液槍準(zhǔn)確移取100 μl的DPPH和100 μl不同濃度梯度的樣品置于96孔板孔中，避光反應(yīng)40 min，在517 nm下測(cè)其吸光度值為獳璱。樣品本底組：準(zhǔn)確移取100 μl的樣品和100 μl的無(wú)水乙醇，其吸光度值為獳璲；空白對(duì)照組：準(zhǔn)確移取100 μl的DPPH和100 μl的無(wú)水乙醇，其吸光度值獳璫。每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率=1-獳璱-A璲 A璫×100%オ

根據(jù)不同濃度梯度的樣品對(duì)DPPH自由基的清除率，繪制6種不同樣品對(duì)DPPH自由基的清除率曲線，并對(duì)各曲線進(jìn)行線性擬合，得到6種不同樣品的獻(xiàn)C50值［20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基最大波長(zhǎng)的確定

結(jié)果顯示，DPPH自由基約在517 nm處有最大吸收峰。

圖2 0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液全波長(zhǎng)掃描結(jié)果

2.2 DPPH自由基穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖3表明，0~2 min隨時(shí)間變化吸光度呈線性迅速下降；2~35 min后變化很小，吸光度趨近于穩(wěn)定狀態(tài)，35 min后吸光度基本無(wú)變化。因此，由DPPH自由基穩(wěn)定性試驗(yàn)可以確定，為了提高清除DPPH自由基測(cè)試精確性，在加入樣品反應(yīng)35~40 min后測(cè)量反應(yīng)物吸光度［19］。

圖3DPPH自由基穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3 樣品的DPPH自由基清除曲線

圖4表明，各樣品對(duì)DPPH的清除率接近指數(shù)關(guān)系，在樣品濃度梯度較低時(shí)清除率隨著濃度增加近似為線性關(guān)系，而濃度較大時(shí)清除率趨于穩(wěn)定。在近似線性范圍內(nèi)，根據(jù)質(zhì)量濃度（μg/ml）玐，清除率（%）玒的關(guān)系對(duì)各曲線進(jìn)行線性擬合［21］。

圖46種樣品對(duì)DPPH自由基的清除曲線

2.4 樣品清除DPPH自由基的能力確定

根據(jù)6種樣品的清除曲線，確定各樣品的獻(xiàn)C50值（見(jiàn)表1）［22］。結(jié)合圖4和表1可以確定，6種樣品的清除能力的大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴?二氯甲烷層>蘿卜葉水提物>β補(bǔ)如藪>石油醚層>檸檬酸。

表16種樣品的線性方程、線性范圍、玆2及IC50值

樣品 樣品名稱 線性方程 線性范圍う蘥/ml 玆2 IC50值う蘥/ml

1 石油醚組分 玒=0.506 9X+27.600 1 1~50 0.927 4 48.6

2 二氯甲烷組分 Y=0.763 3X+32.587 3 1~40 0.893 6 18.0

3 乙酸乙酯組分 Y=1.110 0X+31.233 7 1~30 0.954 6 14.6

4 蘿卜葉水提物 Y=0.746 9X+26.638 8 1~40 0.946 5 28.9

5 β補(bǔ)如藪 Y=0.6031X+28.744 2 1~50 0.932 2 31.4

6 檸檬酸 Y=0.336 5X+20.888 5 1~40 0.996 2 -

3結(jié)論

試驗(yàn)以DPPH自由基最大波長(zhǎng)的確定試驗(yàn)、DPPH自由

基穩(wěn)定性考察為基礎(chǔ)，對(duì)蘿卜葉水提取物、水提物的不同極性部位萃取物、蘿卜中的脂肪油類化合物β補(bǔ)如藪冀行DPPH（1,1捕苯基2踩硝基苯肼）自由基清除能力試驗(yàn)。結(jié)果表明，在乙醇體系、波長(zhǎng)517 nm的條件下，測(cè)定6種樣品清除DPPH自由基的獻(xiàn)C50值，判斷其清除DPPH自由的活性大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴?>二氯甲烷層 >蘿卜葉水提物 >β補(bǔ)如藪>石油醚層>檸檬酸。由此得出結(jié)論，蘿卜具有較好的抗氧化能力。同時(shí)，對(duì)蘿卜抗氧化活性成分的跟蹤分離提供試驗(yàn)依據(jù)。

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