岳備 黃玉蘭 林曉婷 耿士莊 趙國峰 梁曉慶 劉延明

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）お

摘要

［目的］研究黃瓜原生質(zhì)體分離的最佳酶解條件。［方法］以黃瓜子葉和懸浮細(xì)胞為材料，研究不同酶解條件對其原生質(zhì)體的分離效果的影響。［結(jié)果］黃瓜子葉獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體的最佳條件為：酶液組合2%纖維素酶+1.0%果膠酶，酶解時間8 h，酶液濃度0.7 mol/L，酶液pH 5.5。［結(jié)論］該試驗研究了不同酶解條件對黃瓜原生質(zhì)體的分離效果的影響，為黃瓜的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞黃瓜(獵ucumis sativus 獿. )；原生質(zhì)體；酶解條件；離心

中圖分類號 SB642.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06145-03

お

The Effect of Decomposing Conditions on Protoplast Isolation of Cumber

YUE Bei, HUANG Yu瞝an et al

(Faculty of Biological Life, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing, Heilongjiang 163319)

Abstract ［Objective］ To study the optimal enzymolysis conditions on protoplast isolation ofcumber. ［Method］ Using cotyledons and suspension of cumber as test materials, effects of various enzymolysis conditions on protoplast isolation were studied. ［Result］ The optimum conditions for high yield of viable protoplast were as follows: enzyme combination containing 2% cellulase + 1.0% pectinase, mannitol concentration at 0.7 mol/L, enzymolysis time of 8 h and pH=5.5. ［Conclusion］ Effects of different enzymolysis conditions on protoplast isolation of cumber were studied, which will provide basis for further development and utilization.

Key words 獵ucumis sativus 獿.; Protoplast; Enzymolysis conditions; Centrifugation

お

基金項目 黑龍江省青年科學(xué)基金(QC2012C103)；校級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（2013100223003）。

作者簡介

岳備(1991-)，男，河北邢臺人，本科，專業(yè)：制藥工程。*通訊作者，碩士，從事植物細(xì)胞工程研究。

收稿日期 20140529

黃瓜(獵ucumis sativus 獿.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)黃瓜屬(獵ucumis)一年蔓生草本植物，是我國主要的蔬菜作物之一，其播種面積和總產(chǎn)量在我國主要蔬菜中位居前列［1］。“優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗、生態(tài)、高效”黃瓜新品種的選育迫在眉睫。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因抗病育種，可能會產(chǎn)生諸如啟動子、標(biāo)記基因等外來因素，帶來潛在的危險性，并且遠(yuǎn)緣雜交的不親和性阻礙了這些技術(shù)在黃瓜育種中的應(yīng)用。以原生質(zhì)體融合為基礎(chǔ)的體細(xì)胞雜交技術(shù)可以克服遠(yuǎn)緣雜交的前述困難，實現(xiàn)不同物種部分基因組或特異染色體的轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)基因育種應(yīng)用中還可以把外源目的基因?qū)朐|(zhì)體，創(chuàng)造出新的種質(zhì)┳試椽［2］。

分離高質(zhì)量原生質(zhì)體是進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交的前提，黃瓜屬間原生質(zhì)體融合研究還很少，且沒有得到再生植株［3-4］。主要是原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力限制了該方法在黃瓜育種上的應(yīng)用。原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力在很大程度上取決于材料來源、水解酶組成、酶解時間等酶解條件。目前，國內(nèi)對植物黃瓜原生質(zhì)體的制備、純化及融合的研究相對較少，試驗以黃瓜子葉和懸浮細(xì)胞為材料，研究不同酶液組合、酶解時間、酶液滲透壓及酶液pH值等不同條件對其原生質(zhì)體的分離效果，以期為制備高質(zhì)量的黃瓜原生質(zhì)體提供理想條件與參數(shù)，并為進(jìn)一步利用植物細(xì)胞融合技術(shù)改良和生產(chǎn)黃瓜提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

元豐園黃瓜種子；甘露醇，購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；纖維素酶(Onozuka R-10)和果膠酶(Macerozyme R-10)，購自日本。

1.2 方法

1.2.1

無菌苗和胚性愈傷組織的制備。精選飽滿的黃瓜元豐園種子，水浸種10~20 min后，用70%乙醇處理20~30 s，然后用0.1% HgCl2消毒8~10 min，再用無菌水洗滌4~5次，胚根端插入MS附加0.3%蔗糖和0.7%瓊脂的固體培養(yǎng)基中，置于(25±2)℃，1 000 lx光照13~15 h/d下培養(yǎng)，制備無菌苗。

將5~7 d無菌苗子葉葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，用長柄鑷子將切好的外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)獲得初代愈傷組織。初代愈傷組織在3種激素6睟A、IAA、AgNO3的調(diào)控下，繼代培養(yǎng)成胚性愈傷組織。將胚性愈傷組織接種液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，獲得黃瓜懸浮細(xì)胞。

1.2.2

黃瓜子葉和懸浮細(xì)胞的原生質(zhì)體制備［5-7］。選取植株頂端未充分展開的幼嫩子葉，清水沖洗干凈，75%酒精浸泡數(shù)秒，再用0.1%升汞溶液消毒7 min，然后用無菌水清洗4~5次，撕下葉片下表皮，并將去掉下表皮一面置于盛有酶液培養(yǎng)皿中，在黑暗條件下25 ℃恒溫?fù)u床上50 r/min振蕩，以分離原生質(zhì)體。

取繼代5~10 d質(zhì)地疏松的黃瓜懸浮細(xì)胞1~2 g，置于盛有10 ml酶液的培養(yǎng)皿中，蓋上蓋Parafilm膜封口。25 ℃、50 r/min的搖床上黑暗振蕩酶解，以分離原生質(zhì)體。

1.2.3

不同酶解條件對其原生質(zhì)體的分離效果。①酶種類與濃度。酶液由纖維素酶和果膠酶組成以0.9 mol/L甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑。采用隨機組合試驗設(shè)計，其中纖維索酶濃度設(shè)3個水平：2％，1.5 ％，1.0％。果膠酶濃度設(shè)3個水平：2.0％，1.5％，1.0％。②酶解時間。酶解時間設(shè)為2、4、6、8和10 h共5個水平。③甘露醇濃度。甘露醇濃度(﹎oI/L)設(shè)5個水平0.5，0.6，0.7，0.8，0.9。④酶液pH值。酶液的pH值設(shè)5個水平：4.5，5.0，5.5，6.0，6.5。

1.2.4

黃瓜原生質(zhì)體純化與檢測。酶解后，懸浮液用300目濾網(wǎng)過濾，600 r/min離心5 min，收集原生質(zhì)體。收集到的原生質(zhì)體采用界面法［8-9］進(jìn)一步純化。所有試驗重復(fù)3次，取平均值。原生質(zhì)體產(chǎn)量用血球計數(shù)板計數(shù)，以每g鮮重子葉和懸浮細(xì)胞分離得到的原生質(zhì)體個數(shù) (個/g)來表示，用0.01%酚藏紅花染色測定原生質(zhì)體活性，相關(guān)計算式如下：原生質(zhì)體密度(個/ml)=每個小格內(nèi)的原生質(zhì)體平均數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)；原生質(zhì)體產(chǎn)量（個 /g）= 懸浮液中的原生質(zhì)體數(shù)（個/ml）×總體積（ml）/ 質(zhì)量（g）；原生質(zhì)體的完整率(%)=完整原生質(zhì)體個數(shù)(玿)/原生質(zhì)體總數(shù)(X)；完整產(chǎn)率(個/g)=原生質(zhì)體的產(chǎn)率(個/g)×原生質(zhì)體的完整率(%)；存活率(%) = (未染色原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù))×100%；有活力原生質(zhì)體產(chǎn)量（個/g）=原生質(zhì)體產(chǎn)量×存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜胚性愈傷組織誘導(dǎo)及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

由子葉誘導(dǎo)的愈傷組織呈黃綠色，組織生長良好。在優(yōu)化的培養(yǎng)基上進(jìn)行黃瓜細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可不斷增值，狀態(tài)良好(圖1)。

圖1黃瓜原生質(zhì)體（A:子葉；B:懸浮細(xì)胞）

2.2 酶濃度對不同材料黃瓜原生質(zhì)分離的影響

將繼代7 d生長活性較高的懸浮細(xì)胞和7~9 d黃瓜無菌苗子葉，分別置于表1所示2種不同組合酶液中。由表l可知，纖維素酶濃度一定時，隨果膠酶濃度的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量先增后減，當(dāng)果膠酶濃度為1.0％時產(chǎn)量最高。當(dāng)果膠酶濃度一定時，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著纖維索酶濃度先增后減。綜合考慮，原生質(zhì)體產(chǎn)率適中、原生質(zhì)體活力產(chǎn)量較高、完整率較高的酶液組合為纖維素酶2%+果膠酶1.0%。

在原生質(zhì)體密度和活力原生質(zhì)體產(chǎn)量方面，子葉和懸浮細(xì)胞二者作為起始材料出現(xiàn)較大差別。在最佳酶濃度組合下，子葉和懸浮細(xì)胞活力原生質(zhì)體的產(chǎn)率分別為7.5×106個/g和6.9×106個/g，完整率沒有太大的差別。從整體上來看，子葉以其較高的活性和較高的完整率成為最佳可選┎牧?。?/p>

表1 酶液組成對原生質(zhì)體分離的影響

酶液濃度∥%

纖維素酶果膠酶

子葉

原生質(zhì)體總量106個/gFW 活力原生質(zhì)體產(chǎn)量106個/gFW 完整率106個/gFW

懸浮細(xì)胞

原生質(zhì)體總量106個/gFW 活力原生質(zhì)體產(chǎn)量106個/gFW 完整產(chǎn)率106個/gFW

3 1.5 6.5±0.2 6.1±0.4 5.7±0.1 7.6±0.1 6.0±0.1 5.6±0.1

3 1.0 6.7±0.1 6.3±0.1 5.8±0.4 7.8±0.4 6.1±0.4 5.8±0.4

3 0.8 6.3±0.4 5.8±0.2 5.4±0.5 7.5±0.2 5.8±0.3 5.5±0.2

2 1.5 6.9±0.2 6.4±0.7 6.0±0.4 7.9±0.4 6.3±0.2 6.1±0.3

2 1.0 7.8±0.4 7.5±0.1 6.9±0.2 8.9±0.3 6.9±0.4 6.8±0.4

2 0.8 7.5±0.2 7.0±0.2 6.7±0.1 8.8±0.6 6.7±0. 6.8±0.2

1 1.5 6.2±0.1 5.6±0.3 5.3±0.5 6.7±0.1 5.4±0.4 5.4±0.4

1 1.0 6.5±0.4 6.0±0.5 5.3±0.8 6.9±0.3 5.9±0.2 5.5±0.5

1 0.8 5.9±0.5 6.1±0.2 5.2±0.4 6.4±0.4 5.3±0.3 5.3±0.3

2.3 酶解時間對黃瓜原生質(zhì)體分離的影響

在2.0%纖維素酶+1.0%果膠酶酶液中，研究了不同的酶解時間對子葉原生質(zhì)體游離產(chǎn)率和完整率的影響。結(jié)果（表2)表明，在酶解4 h后便有少量原生質(zhì)體生成，隨著時間的延長，原生質(zhì)體的數(shù)量也逐漸增加；酶解8 h便產(chǎn)生大量原生質(zhì)體，其活力和完整率為最佳，隨著酶解時間的延長，會出現(xiàn)活力和完整率下降的趨勢。

お

表2 酶解時間對原生質(zhì)體分離的影響

組別 酶解な奔洹蝖 原生質(zhì)體總量106個/gFW 活力原生質(zhì)體產(chǎn)量106個/gFW 完整率106個/gFW

1 2 0.6±0.2 0.3±0.1 0.1±0.1

2 4 3.1±0.3 2.5±0.2 1.8±0.2

3 6 4.8±0.4 4.1±0.2 3.1±0.2

4 8 7.1±0.2 7.0±0.4 5.9±0.5

5 10 6.9±0.2 6.7±0.3 4.6±0.3

2.4 甘露醇濃度對原生質(zhì)體分離效果的影響

在2.0%纖維素酶+1.0%果膠酶酶液中添加不同濃度的甘露醇，酶解8 h，比較原生質(zhì)體的分離情況，結(jié)果見表3。隨著甘露醇濃度的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量和有活力原生質(zhì)體產(chǎn)量都隨之增加，當(dāng)濃度達(dá)0.7 mol/L時，有活力原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，為7.0×106個/g，完整率為5.9×106個/g，獲得的原生質(zhì)體形狀、大小基本一致，邊緣清晰，內(nèi)含物多，完整率較高。隨著甘露醇濃度的升高，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和有活力原生質(zhì)體的產(chǎn)量開始下降。

表3 不同甘露醇濃度對原生質(zhì)體分離的影響

組別 甘露醇づǘ取蝝ol/L 原生質(zhì)體總量106個/gFW 活力原生質(zhì)體產(chǎn)量106個/gFW 完整率106個/gFW

1 0.5 5.6±0.3 5.0±0.6 4.1±0.3

2 0.6 6.4±0.2 5.9±0.5 4.7±0.2

3 0.7 7.8±0.2 7.0±0.2 5.9±0.4

4 0.8 6.9±0.5 6.7±0.3 4.6±0.2

5 0.9 6.8±0.4 5.9±0.1 4.3±0.3

2.5 酶液pH值對黃瓜原生質(zhì)體分離的影響

在2.0%纖維素酶+1.0%果膠酶酶液中添加0.7 mol/L甘露醇，酶解8 h，比較原生質(zhì)體在不同pH值時的分離情況，結(jié)果見表4。當(dāng)pH為4.5時，有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)量較低，細(xì)胞完整率較低，隨著pH值的逐漸升高，產(chǎn)量逐步增加，原生質(zhì)體狀態(tài)較好；當(dāng)pH為5.5時，活力原生質(zhì)體產(chǎn)量高（7.0×106個/g），有活力原生質(zhì)體產(chǎn)率和完整率都較高；隨著pH值的升高，有活力原生質(zhì)體的產(chǎn)量開始下降，完整率降低。

表4 不同酶液pH對原生質(zhì)體分離的影響

組別 pH值mol/L 原生質(zhì)體總量106個/gFW 活力原生質(zhì)體產(chǎn)量106個/gFW 完整率106個/gFW

1 4.5 3.1±0.2 2.7±0.1 2.4±0.2

2 5.0 4.5±0.3 3.9±0.3 3.2±0.3

3 5.5 7.8±0.5 7.0±0.4 6.2±0.1

4 6.0 6.9±0.4 6.1±0.5 4.7±0.4

5 6.5 5.1±0.3 4.2±0.3 3.1±0.3

3結(jié)論與討論

起始材料是影響植物原生質(zhì)體分離培養(yǎng)的重要因素［10-11］。試驗以黃瓜無菌苗子葉和懸浮細(xì)胞為材料，對分離制備的原生質(zhì)體的效果進(jìn)行比較，得出子葉制備的原生質(zhì)體優(yōu)于懸浮細(xì)胞，并且原生質(zhì)體的活性較高，平均為7.5×106個/g；懸浮細(xì)胞的產(chǎn)率也較高，但其活力比子葉低，平均為6.9×106個/g，完整率沒有太大的差別。雖然懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體總量高于子葉分離的原生質(zhì)體，但其原生質(zhì)體活力產(chǎn)量卻低于子葉，可能是由于懸浮細(xì)胞傳代次數(shù)多，造成活性有所降低。

游離原生質(zhì)體時，適宜的酶解條件因植物的種類不同有很大差異［12-14］。試驗中酶液組成以2%纖維素酶+1%果膠酶為最佳。原生質(zhì)體游離時酶解是關(guān)鍵，而酶解中酶的種類和濃度更為重要。以往試驗多采用3種以上酶，而且酶解時間很長，一般在10 h以上［15-17］。試驗中酶液組成以R-10纖維素酶2%+R-10果膠酶1%較合適，只采用2種酶，僅8 h就可得到大量高活力的原生質(zhì)體。一般認(rèn)為原生質(zhì)體的分離，纖維素酶和果膠酶是必要的［18］，主要是纖維素酶和果膠酶更易接觸細(xì)胞壁和原生質(zhì)體間的果膠，從而使原生質(zhì)體更易達(dá)到分離［19］。試驗中隨著酶解時間的延長，原生質(zhì)體的數(shù)量也逐漸增加；酶解8 h便產(chǎn)生大量原生質(zhì)體，其活力和完整率為最佳，隨著酶解時間的繼續(xù)延長，會出現(xiàn)活力和完整率下降的趨勢?？赡苁怯捎谑ゼ?xì)胞壁后，原生質(zhì)體受到酶液的傷害［10］。研究中采用甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，當(dāng)甘露醇濃度較低時細(xì)胞膜容易破裂，造成原生質(zhì)體的數(shù)量偏低；當(dāng)甘露醇濃度較高時，原生質(zhì)體則易失水而收縮影響正常的代謝活動，其生理活性就會降低［20］。甘露醇濃度為0.7 mol/L時得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力及完整率最佳。酶液的pH對原生質(zhì)體的產(chǎn)率和活力都有很大的影響，試驗中酶液最適pH為5.5，太低或過高時，產(chǎn)量都不高。其原因是2種酶的活力受pH影響，纖維素酶的最適pH是5.5~6.0，果膠酶有效作用的pH是2.56。可能由于二者的互作效應(yīng)，試驗中酶液的最佳pH值為5.5。

試驗結(jié)果表明，黃瓜子葉獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體的最佳條件為：酶液組合2%纖維素酶+1.0%果膠酶，酶解時間8 h，酶液濃度0.7 mol/L，酶液pH 5.5。

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