任緒瑞 劉艷玲 楊美 陳媛媛 王冬良 陳友根

摘 要 利用單因素分析法對影響菰SRAP-PCR擴增效果的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板和引物濃度5種因素進行了優(yōu)化。結果表明：建立了適合菰基因組的SRAP-PCR的體系：1 μL 10×Buffer、0.5 U Taq DNA聚合酶、2 mmol/L MgCl2、50 ng模板DNA、0.20 mmol/L dNTPs、正反向引物的濃度各為0.7 μmol/L，共10 μL。選取5對引物，利用該體系對72份菰樣本進行PCR擴增，共獲得132條清晰的譜帶，其中91條具有多態(tài)性，比率為68.9%。菰SRAP-PCR反應體系的優(yōu)化和建立將為利用該標記進行種質遺傳多樣性分析和連鎖圖譜構建等研究提供技術支持。

關鍵詞 菰；SRAP；PCR反應體系；優(yōu)化

中圖分類號 S511.9 文獻標識碼 A

SRAP（Sequence-related amplified polymorphism，序列相關擴增多態(tài)性）是一種不同于RAPD、SSR、AFLP、SNP的分子標記方法，由美國加州大學作物系的Li等[1]于2001年從蕓苔屬（Brassica L.）植物中研發(fā)而來。該標記因具有穩(wěn)定、簡單和易于測序等特性而被廣泛應用于植物的品種鑒定[2]、遺傳多樣性分析[3]、遺傳圖譜構建[4-5]等研究，其研究對象涉及果樹[6]、蔬菜[7-8]和糧食作物[9]等。

菰（Zizania latifolia Turcz.），是稻族（Oryzeae）菰屬（Zizania L.）的多年生挺水禾草，具有廣泛的利用價值。菰的莖葉是優(yōu)良的飼料，其嫩莖經過黑粉菌（Ustilago esculenta P. Henn）感染后成為中國重要的水生蔬菜茭白[10]。由于菰和水稻（Oryza sativa L.）親緣關系較近，且菰具有高產、抗逆性強等優(yōu)點，是水稻品種改良的重要種質資源[11]。野生菰分布廣泛，在許多濕地中是優(yōu)勢種或建群種[12]，對于湖岸帶的穩(wěn)定具有重要的生態(tài)功能。雖然野生菰資源具有重要的育種價值和生態(tài)功能，目前關于菰野生種群的遺傳多樣性研究卻十分有限，應用的標記有Adh1a序列[13]和SSR標記[14]。SRAP作為一種新型分子標記，雖然在菰品種資源的遺傳變異分析中得到初步應用，但其擴增條帶產率和多態(tài)比率都較低[15]，其反應體系尚需優(yōu)化。為了有效運用SRAP標記研究野生菰資源的遺傳變異，本研究以取自長江中下游和東北三江平原的2份野生菰為材料，對適合菰的SRAP-PCR分析反應體系進行了探討，為菰種質資源分析、遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構建等研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 所用2個菰（Z. latifolia）材料分別選自長江中下游的龍感湖（N 30°13′48"，E 116°15′40"）和三江平原黑龍江沿岸（N 49°12′15"，E 129°43′27"）。采集樣本的健康幼嫩葉片，放入裝有硅膠的密封袋中干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 由加拿大Fermentas MBI公司生產的10×Taq Buffer（不含MgCl2），5 U/μL Taq DNA polymerase，25 mmol/L MgCl2；由瑞士Roche試劑公司生產的10 mmol/L dNTPs；由美國Promega公司生產的DNA Marker；美國Amresco公司生產的CTAB、Tris-base、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED。SRAP標記引物參照Li等[1]，所選引物序列見表1，由上海桑尼生物技術有限責任公司合成，稀釋至10 μmol/L備用。

1.2 方法

1.2.1 菰基因組DNA提取與檢測 采用改良的CTAB方法[16]提取植物基因組總DNA；用凝膠成像系統（Bio-Rad Gel Doc XR+）觀察檢測DNA質量，通過紫外分光核酸測定儀（NanoDrop Lite Spectrophotometer）測定DNA濃度。

1.2.2 SRAP反應體系優(yōu)化 對影響擴增的Mg2+、dNTPs、DNA模板、Taq DNA聚合酶、引物5個因子進行單因子試驗，在反應體系中其它成分不變的情況下，將每個因子設置4個梯度（表2）。PCR反應體積為10 μL，基礎反應體系為：模板DNA 50 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，10×Buffer緩沖液1 μL，MgCl2 2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，正反引物各0.7 μmol/L。

1.2.3 PCR擴增 本實驗使用Bio-Rad MyCycler Thermal Cycler PCR儀進行PCR擴增，PCR反應參考Li等[1]的標準擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 反應產物的檢測 于PCR反應產物中加5 μL的上樣緩沖液，94 ℃變性5 min后，取樣2.5 μL用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，緩沖液為0.5×TBE，以47 W恒功率電泳1.5 h（JY3000高壓電泳儀）。取下膠板后置于1 g/L的AgNO3中浸泡15 min，并以去離子水快速沖洗5 s，然后浸入1.5 L的顯影液（6 ml甲醛+0.6 g Na2CO3+30 g NaOH）中搖5 min。最后用流水沖洗干凈。

2 結果與分析

2.1 菰基因組DNA質量的檢測

所提取菰基因組DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示2份菰材料的DNA條帶清晰（圖1）。紫外分光光度計檢測顯示，長江中下游龍感湖和東北三江平原黑龍江樣本DNA的A260/A280分別為1.987和1.973，A260/A230比值為2.011和2.032， 能夠滿足SRAP標記技術對DNA質量的要求。2樣本的DNA濃度分別為693.6、831.9 ng/μL。

2.2 各因子對SRAP-PCR反應結果的影響

2.2.1 模板濃度 在本試驗中，不同濃度的模板DNA普遍擴增較好（圖2），但模板為20 ng時，me2em1 B1和me6em3 A1少數條帶擴增較弱，me2em1 A1、me8em1 A1條帶的背景較深；模板為35 ng時，me6em3和me8em1所擴增條帶亮度有所增強，帶型比較清晰，但me2em1和me6em1條帶的背景比較深；模板DNA為50 ng時，5對引物的擴增效果均比前2種DNA模板用量的效果好，尤其是樣本A，A3的條帶要比A1、A2、A4更清晰；模板為65 ng時，me2em1 A4、me6em1 A4、me8em1 A4條帶的背景較深。通過比較5對引物在不同模板DNA用量下擴增的穩(wěn)定性，確定最佳DNA用量為50 ng。

2.2.2 Mg2+濃度 從圖3中可以看出，Mg2+對PCR的影響很大。Mg2+濃度為1.0 mmol/L時，擴增條帶數目較少，帶型清晰度不夠，如me2em1 A1在145 bp和200 bp處缺少擴增條帶，me6em1 A1在300、180、160 bp處缺少擴增條帶；隨著Mg2+濃度增加，擴增條帶數目加強，帶型清晰度增加；當Mg2+濃度為1.5 mmol/L時，me2em1 B2、me6em1 A2和me8em1A2、B2均有非特異擴增的條帶出現；Mg2+為2.0 mmol/L時擴增效果最好；當Mg2+的濃度達到2.5 mmol/L時，me5em4 B4、me8em1 B4帶型的清晰度有所降低。5對引物組合中，Mg2+濃度變化對me2em1的影響最為明顯。

2.2.3 dNTPs濃度 由圖4可見，4種不同濃度的dNTPs對PCR都產生有效的擴增，只是隨著濃度的增加，特異性有所增強，特別是在龍感湖的樣本中比較明顯。dNTPs濃度為0.1 mmol/L時，條帶清晰，但是相對較弱，部分條帶有缺少的現象，如me6em3 A1在170 bp處缺少條帶；濃度為0.15 mmol/L時，擴增條帶數目較多；濃度為0.20 mmol/L時，擴增條帶多，帶型清晰，多態(tài)性最好，在me6em3、me8me1這2對引物的擴增中尤為明顯；濃度上升到0.25 mmol/L時，條帶清晰度開始降低，me6em3 B4在127、150 bp處，me8em1 B4在110 bp處有條帶缺失的現象。因此確定最佳dNTPs濃度為0.20 mmol/L。

2.2.4 Taq DNA聚合酶用量 由圖5可以看出，不同濃度的Taq DNA聚合酶擴增的條帶亮度相差不是特別明顯。但是Taq DNA聚合酶用量為0.25 U時，有少數個體擴增的條帶數目減少，例如me8em1 A1在350 bp處有條帶缺失的現象；當用量為0.50 U時，條帶增多，帶型穩(wěn)定清晰；用量為0.75、1.0 U時，me8em1 A3、A4、B3、B4帶型彌散不清晰。本著節(jié)約的原則，選擇最佳Taq DNA聚合酶用量為0.5 U。

2.2.5 引物濃度 本研究中4種引物濃度下的PCR擴增效果相差不大（圖6），條帶均比較清晰。具體分析如下：當體系的引物濃度為0.4 μmol/L時，條帶較弱且背景較深，如me2em1 A1、me5em4 A1；當引物濃度為0.7 μmol/L時，帶型清晰，亮度增加；當增加至1.0 μmol/L時，me6em1 A3、B3、me5em4 A3、B3的條帶模糊，背景加深；引物濃度為1.3 μmol/L時，部分引物如me6em A3、A4的帶型清晰，但在其他居群及引物組合中擴增效果不好。因此最佳的引物濃度為0.7 μmol/L。

2.3 SRAP-PCR反應體系的驗證

根據前面各濃度的單因素梯度實驗可以得到適合菰SRAP-PCR的反應體系為：MgCl2 2 mmol/L、DNA 50 ng、Taq DNA聚合酶0.5 U、dNTPs 0.2 mmol/L、正反引物濃度均為0.7 μmol/L，總體積為10 μL。為了檢測該體系的穩(wěn)定性，選用5對引物（me2em1、me6em1、me6em3、me5em4和me8em1），采用該優(yōu)化體系對本實驗室保存的72份菰樣進行了擴增（圖7）。經統計，5對引物共獲得132條清晰的譜帶，其中91條具有多態(tài)性，比率為68.9%。表明建立的反應體系穩(wěn)定可靠，可用于進一步的遺傳分析。

3 討論與結論

作為基于PCR的分子標記技術，SRAP與其它PCR技術相似，其擴增結果易受反應體系中多種因素的影響[17-19]。如模板濃度低，模板與引物的結合率小而導致無擴增帶，而濃度過高則會引起模板與模板結合率高，同樣引起其與引物結合率變小[20]；高濃度的Taq DNA酶會導致非特異性擴增產物的產生，用量偏低又會導致新鏈合成的效率下降[21]；Mg2+濃度的變化會影響SRAP帶型的清晰度，從而影響酶的活性及產物合成的忠實性[22]。此外，引物和dNTPs 濃度等因素也會對擴增結果產生較大影響，因而優(yōu)化SRAP-PCR反應的條件是獲得可靠結果的關鍵。本試驗對Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板5種組分進行優(yōu)化，發(fā)現Mg2+對擴增的結果影響最大，另外4種因子對擴增結果也有一定程度的影響，這與對中國蘭[23]、紅松[24]、石蒜[25]的研究結果相似。另外，也有研究顯示在觀賞海棠[26]、蓮[20]的SRAP-PCR中，dNTPs、Taq酶均是擴增的最大影響因子，表明植物的基因組差異可能導致擴增體系存在差異。

本研究利用5對引物組合共獲得132個擴增位點，其中多態(tài)位點有91個（占68.9%），其擴增產率和多態(tài)性比率與以往對蓮[20]、木瓜[27]、蔥[28]的研究相似。丁潮洪等[15]曾利用SRAP標記對收集于浙江省的35份菰栽培品種和地方品系進行擴增，然而其擴增產率和多態(tài)率明顯偏低，利用47對引物僅獲得153個擴增位點，其中多態(tài)位點11個（占7.2%）。除了擴增反應體系的不同外，這2項研究在擴增產率上存在的巨大差異也許與反應程序有很大相關性。本研究的PCR擴增所用程序參照Li等[1]，最初5個循環(huán)退火溫度為35 ℃，可使引物與模板易于結合，隨后35個循環(huán)的退火溫度升高為50 ℃，保證了結果的可重復性和擴增產率。在丁潮洪等[15]的研究中，后來循環(huán)的退火溫度為53 ℃，雖然退火溫度的升高會使結果更加穩(wěn)定，但這將會大幅度降低擴增條帶的數目。另外，本研究所選的實驗樣本分別來源于東北和長江中下游的野外種群，其遺傳背景差異較大，因而相對于菰的栽培品種會顯示出更高的多態(tài)性。

綜上所述，根據優(yōu)化結果，本研究確定了菰SRAP-PCR擴增的最佳反應體系為：MgCl2 2 mmol/L，模板DNA 50 ng，Taq DNA聚合酶0.5 U，dNTPs 0.2 mmol/L，正反向引物濃度均為0.7 μmol/L，共10 μL。檢驗表明，利用此反應體系擴增譜帶清晰、多態(tài)性高且穩(wěn)定性好。本研究為菰的種質資源鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、基因定位等研究奠定基礎，為后續(xù)的研究提供了較好的技術支持。

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