張俊 王靜毅 陳友 馮慧敏 武耀廷 王沛政

摘 要 應(yīng)用SSR分子標記技術(shù)，結(jié)合structure軟件分析了32份香蕉種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系。結(jié)果顯示32份香蕉群體分為4大亞群：本地大蕉群、ABB群（包含引進大蕉亞群、粉蕉群）、AAA群及mix群。國內(nèi)大蕉與引進大蕉遺傳關(guān)系較遠；粉蕉和大蕉各個品種之間存在豐富的遺傳多樣性；AAA群的皇帝蕉、Yangambi KM5和AAcv Rose栽培品種與我國早期引進的主栽品種Williams遺傳關(guān)系較遠；本地大蕉群中的酸芭蕉（ABB）和東莞中把大蕉（ABB）與其它大蕉相聚較遠；ABB群組中巨型大蕉（ABB）和FHIA-03（AABB）與該群中的其它品種相聚較遠；華農(nóng)15和Williams沒有被區(qū)分開，它們可能是同一克隆。研究結(jié)果表明基于模型的structure聚類分析也能用于遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞 香蕉；SSR；Structure分析；聚類分析

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

香蕉（Musa spp）是世界上產(chǎn)量最大的水果作物，在發(fā)展中國家是除水稻、小麥、玉米之外的第一大食物來源[1]。香蕉的主要栽培品種是由尖苞葉蕉（Musa acuminata Colla， A基因組）和長梗蕉（M. balbisiana Colla， B基因組）這2個原始野生蕉種內(nèi)、蕉種間雜交或變異進化而成的[2]。香蕉分為鮮食香蕉（dessert bananas）和熟食香蕉（cooking bananas or plantains）。根據(jù)植株形態(tài)上的特征及經(jīng)濟性狀，我國習慣上把鮮食香蕉品種分為香牙蕉（AAA）、大蕉（ABB）、粉蕉（ABB）和龍牙蕉（AAB）等，并通稱為香蕉。香蕉種質(zhì)資源豐富，種類品種繁多，具有特殊的生物學特性（如多倍體、無性繁殖、營養(yǎng)結(jié)實、小染色體等），除三倍體外，還有二倍體和四倍體品種（系）。其種質(zhì)資源的系統(tǒng)學研究一直是個難題，這不但阻礙了香蕉種質(zhì)資源的合理利用，也影響香蕉的品種改良與育種。

國內(nèi)外香蕉種質(zhì)遺傳多樣性研究已有不少報道。Gawel等[3]報道了利用RFLP技術(shù)對香蕉屬的19個種和亞種的分類和系統(tǒng)發(fā)育的研究。Howell等[4]利用RAPD引物對9個栽培蕉種質(zhì)系統(tǒng)分析認為AA、AAA、AAB、ABB和BB 5種基因型能反映出所研究的栽培種的特征。國內(nèi)冀小蕊等[5]利用SSR分子標記發(fā)現(xiàn)引進的香蕉種質(zhì)包括A和AB基因中均存在有遺傳差異較大的亞群。利用RAPD標記陳源等[6]對福建香蕉種質(zhì)資源的基因組的聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)Simmonds分類法的結(jié)果一致。

Structure軟件中的多樣性分析方法是一種基于模型的聚類方法（貝葉斯聚類方法對群體進行分類）。其原理是：假設(shè)群體中含有K個類群（K是未知的），這些類群在每個位點上都具有一套不同的等位基因頻率。該軟件可以分析多種分子標記（SSR、RFLP、SNP等）。不僅可以分析群體的遺傳多樣性，同時亦能用于分析群體遺傳結(jié)構(gòu)等。在此基礎(chǔ)上可以分析標記的連鎖不平衡類群和進行性狀與標記的關(guān)聯(lián)分析作圖[7-11]。Structure軟件在人類和動物的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)中研究應(yīng)用廣泛[12-18]，目前尚未見利用structure軟件研究香蕉親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)的報道。本研究基于香蕉種質(zhì)資源的SSR分子數(shù)據(jù)，利用structure軟件分析香蕉種質(zhì)的親緣關(guān)系，為香蕉資源分類研究和合理利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉葉片樣品取自廣州農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所國家香蕉種質(zhì)圃和中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所香蕉種質(zhì)圃（表1）。

1.2 DNA的提取以及SSR標記鑒定

DNA提取采用CTAB方法[19]。PCR反應(yīng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染方法參照文獻[20]進行。結(jié)果用“1”和“0”記錄帶的有或無，“-9”表示條帶缺失。

1.3 群體結(jié)構(gòu)分析

用Structure 2.3軟件[21]來分析群體結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性分析，估計最佳群體組群數(shù)K，軟件中K取值范圍設(shè)置1～8，7次重復(fù)，采用admixture model，計算ΔK值[22]作為衡量最佳K值的標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體結(jié)構(gòu)分析

SSR標記多態(tài)性分析的結(jié)果見王靜毅等[23]?；赟SR標記的371條差異條帶的基因型作為群體結(jié)構(gòu)分析的數(shù)據(jù)，利用structure軟件參照ΔK的算法[22]對32份香蕉材料群體結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果從圖1可以看出，當k=3時，ΔK達到最大。依據(jù)k=3時Simulation Result中的bar plot可以繪制各品種在各群中所占比例（圖2）。圖2可以看出，利用structure軟件分析，32份香蕉材料分成3大類群，分別用3種顏色來表示。柱狀圖描述的是不同品種被分到這三類群中所占比例。圖中可以看出，大部分品種的分類與基因型分類一致，即表現(xiàn)出structure分類結(jié)果與傳統(tǒng)Simmonds分類結(jié)果的一致性，但也存在著一定的差異性。在Simulation Result中（表2）可以得到k=3時，各品種被分配到各群體中的概率Q值，將同一類群下Q≥0.70的品種劃分到一組。

2.2 品種的遺傳多樣性分析

利用structure軟件分析得到的聚類三角圖（圖3）。圖中的3個頂點代表了3個群組（本地大蕉群組、ABB群組、AAA群組），圖中具有相同顏色的點代表相似的基因型，點與點之間的二維距離衡量品種之間的遺傳距離。從圖中可以看出，32份香蕉種質(zhì)之間存在著豐富的遺傳多樣性。根據(jù)Q值劃分到ABB群組中的m42（巨型大蕉ABB）和m59（FHIA-03 AABB）與該群中的其它品種遺傳距離較遠；本地大蕉群中的m41（酸芭蕉ABB）和m46（東莞中把大蕉ABB）與其它大蕉遺傳距離較遠；AAA群組中的m1、m4、m8和m32單獨聚到一起（AA亞組）。三角圖中間的m60、m2、m55、m56由于與三個類群差異較大，被聚為Mix群。

2.3 香蕉種質(zhì)的親緣關(guān)系分析

經(jīng)過第1輪structure分析，32份香蕉種質(zhì)被分成4個群體，各個群體中是否還存在亞群，需要在各個群體內(nèi)部再進行一次structure分析，如此反復(fù)，直至群體內(nèi)部不存在亞群狀態(tài)，各個品種被完全分開。判斷是否存在亞群的標準為：是否具有顯著差異的△K存在。本研究進行了4輪structure分析，最終將這32份種質(zhì)分為4個種群：Ⅰ：本地大蕉型；Ⅱ：AAA型；Ⅲ：ABB型；Ⅳ：mix型。其中Ⅰ類群包含：尖峰嶺大蕉、興隆山芭蕉、東莞高把大蕉、木棉蕉組成的第一亞群和酸芭蕉和東莞中把大蕉各自獨立的兩個亞群。Ⅱ類群：皇帝蕉、Yangambi KM5、Pisang Ceylan和AAcv Rose為一組的第一亞群、FHIA-02、FHIA-18、SH-3640、Grose Michel、華農(nóng)15、Williams為一組的第二亞群，其中華農(nóng)15和Williams經(jīng)過4輪structure分析依然分不開；Ⅲ類群又可以分為三個亞群：粉蕉組（保亭粉蕉、廣粉、三亞粉蕉、FHIA-01、FHIA-03）；引進大蕉組：MCachaco、孟加拉大蕉（MCachaco和孟加拉大蕉在之后的分析中聚在一起）、巨型大蕉、華農(nóng)芭蕉1號；第三亞群：?？贐B、華農(nóng)芭蕉2號、金手指。Mix種群中包含：FHIA-21、CRBP-39、Pisang Jari Buaya AA和BITA-3（圖4）。

3 討論與結(jié)論

3.1 structure軟件的聚類分析方法

用于分析群體結(jié)構(gòu)常見的聚類方法主要有兩種。一是基于遺傳距離的方法。計算一對距離矩陣，計算出每對樣品之間的距離。這種矩陣再運用圖示來表示出來（例如樹狀圖或者多維比例圖），最后根據(jù)經(jīng)驗將群體進行分類。二是基于模型的方法（Structure）。該方法假定每個類群中的觀測值是隨機來自于一些參數(shù)模型中。然后運用一些統(tǒng)計學方法（最大似然值或者貝葉斯方法）得到的各個類群的參數(shù)值來對群體進行分類?；谶z傳距離方法，其分類結(jié)果太過于依賴遺傳距離的測定和研究者對于圖表的陳述，結(jié)果由于人為干擾因素較大，同時不能利用到樣品的額外信息，例如：樣品的地理位置信息?；谀Ｐ偷姆椒▋?yōu)點是可以將各樣品的額外信息（地理位置）同遺傳信息結(jié)合來對群體分類，同時分類結(jié)果與遺傳距離相比更加可靠。但structure 2.3版本不適用一些連鎖緊密的標記。

本文利用Structure軟件進行數(shù)學模型聚類來分析，主要依據(jù)運行結(jié)果中的似然值[LnP（D）]的變化來繪制△K的變化圖，選擇出最佳K值（分類群組）。在群組的劃分中，選擇在各品種被分配到同一類群下概率Q值≥0.70的品種劃分到一組。并多次運行structure軟件直至群體中無亞群存在。本研究利用香蕉種質(zhì)資源的SSR基因型數(shù)據(jù)作為structure分析中各樣品的ID信息，以此來對32份香蕉種質(zhì)進行分類，結(jié)果顯示利用structure軟件能將材料中的亞群分開，與使用UPGMA聚類分析相比顯示出獨特的優(yōu)越性。

3.2 香蕉種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)分析比較

本實驗供試的包括AA、BB、AAA、AAB、ABB、AAAA、AAAB、AABB和ABBB 9種類型的32份香蕉種質(zhì)，structure分類結(jié)果與香蕉在基因型上的劃分基本一致。其中4份香牙蕉（AAA）種質(zhì)在被分到同一類群。3份二倍體（AA）種質(zhì)之間的多樣性差異較大，這與它的多樣性起源有關(guān)系。二倍體（AA）栽培蕉由小果野蕉種內(nèi)雜交或直接突變而來，因小果野蕉種內(nèi)變異較大，這些遺傳變異豐富的二倍體（AA）種質(zhì)為育種提供基礎(chǔ)。本研究表明AAA群體中的AA型亞群與該群中的其它亞群相聚較遠，基因型為AAB的Pisang Ceylan被劃分到與基因型為AA的皇帝蕉、AAcv Rose為一組。在B型基因組方面，同為ABB基因型的粉蕉和大蕉被分開，同為大蕉的國內(nèi)大蕉組和引進大蕉組并未聚在一起，結(jié)果與王靜毅等[23]一致?；蛐蜑锳ABB的FHIA-03被劃分到粉蕉組。在已劃分的群組中發(fā)現(xiàn)了很多亞群存在，在國內(nèi)大蕉組中，酸芭蕉和東莞中把大蕉獨立成亞群；?？贐B被分到ABB組中，且與華農(nóng)芭蕉2號、金手指組成單獨亞群；在引進的大蕉組中，MCachaco和孟加拉大蕉單獨成一亞群，這些結(jié)果在王靜毅等[23]使用UPGMA聚類分析結(jié)果中并未分開。Sotto等[25]和Geering等[26]研究發(fā)現(xiàn)野生芭蕉（M. balbisiana）BB基因組中含有較強的病性，本研究對指導(dǎo)抗病育種有一定的意義。FHIA-02（AAA）和Williams（AAA），F(xiàn)HIA-21（AAAB）和Pisang Jari Buaya（AA）， FHIA-18（AAAB）和SH-3640（AAAB）分別聚在相同的組群，反映了它們之間真實的遺傳關(guān)系。華農(nóng)15和Williams經(jīng)過4輪structure分析依然分不開（不存在顯著的△K），說明它們可能分別是同一克隆。本地大蕉群中的酸芭蕉（ABB）和東莞中把大蕉（ABB）與其它大蕉相聚較遠；ABB群組中巨型大蕉（ABB）和FHIA-03（AABB）與該群中的其它品種相聚較遠。

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