張偉　陳熠　李增平

摘 要 調查了海南八門灣8種紅樹植物根際叢枝菌根真菌物種資源的分布。結果表明：8種紅樹均被叢枝菌根真菌侵染，但侵染程度各不相同；經(jīng)初步分離、鑒定，共確定叢枝菌根真菌4屬16種：分別為無梗囊霉屬（Acaulospora）6種，巨孢囊霉屬（Gigaspora）2種，球囊霉屬（Glomus）7種，F(xiàn)uscutata 1種。其中球囊霉屬和無梗囊霉屬為優(yōu)勢屬，首次在紅樹植物根際分離到巨孢囊霉屬和Fuscutata兩屬真菌，F(xiàn)uscutata savannicola為我國叢枝菌根真菌新記錄種。

關鍵詞 紅樹林；叢枝菌根真菌；物種多樣性；Fuscutata savannicola

中圖分類號 Q939.5 文獻標識碼 A

紅樹林生長于熱帶及亞熱帶海岸灘涂附近，受海水周期性浸淹，被譽為“海上森林”。它蘊含著豐富的動植物以及微生物資源，具有非常重要的生態(tài)和經(jīng)濟價值[1]。叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungus，AMF）廣泛分布于自然界中，能與絕大多數(shù)植物形成緊密聯(lián)系的共生體系，是一類極其重要的土壤微生物[2]。國外Sengupta[3]等報道了AMF存在于紅樹林生態(tài)系統(tǒng)之中；國內(nèi)王桂文[4]等對欽州灣紅樹林叢枝菌根進行初步研究；Wang等[5]也對深圳福田和珠海紅樹林叢枝菌根真菌進行了研究。但國內(nèi)有關紅樹林AMF資源的研究還相對較少，尚需進一步完善。海南島八門灣是海南島面積最大、樹種最多、紅樹群落保持較完整的紅樹林自然保護區(qū)[6]，筆者對八門灣紅樹林根際AMF物種多樣性進行了初步調查，對該區(qū)域內(nèi)AMF物種數(shù)量及其分布進行研究，以期為進一步研究紅樹林AMF，開發(fā)紅樹林AMF資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2012年10月至2013年5月間，2次在海南省文昌市八門灣紅樹林保護區(qū)的不同紅樹群落區(qū)域內(nèi)進行土樣采集（表1）：隨機選擇5株樹齡較長、長勢良好的紅樹植株，在離氣生根約10 cm 處采樣，首先去掉表面枯葉腐殖層（1～5 cm）；后挖取0～15 cm深的土壤裝袋（土壤質量約5 kg）；樣品采回后于陰涼處自然涼干，去除雜質后保存?zhèn)溆谩２杉寥罉悠窌r兼采集植株根樣放入FAA液（95%乙醇50 mL、40%甲醛5 mL、冰醋酸5 mL、蒸餾水35 mL）中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 AMF的分離和鑒定[2]

1.2.1 根樣處理 將FAA固定液中的根系剪成1 cm小段，放入燒杯清水沖洗，然后加入5% KOH溶液，在90 ℃水浴鍋水浴約60 min，嫩根時間稍短，老根則適當延長時間；水浴后用水清洗數(shù)次，再加入2% HCl溶液浸泡2～3 min；清洗掉酸液后加入0.01%酸性品紅乳酸甘油染色（乳酸875 mL、甘油63 mL、蒸餾水63 mL、酸性品紅0.1 g），放回90 ℃水浴鍋水浴約60 min；回收染液，將根樣清洗數(shù)次后鏡檢[7]。

經(jīng)過上述處理的根樣，挑取制片并置于顯微鏡下觀察拍照，記錄下AMF在每個根段上的侵染情況，計算出每個根段的侵染率，取平均值為根樣侵染指標。

侵染率=（具有叢枝菌根結構的根段長度/觀測根段長度）×100%。

根樣侵染率=∑（具有叢枝菌根結構的根段長度/觀測根段長度）/觀察總根段數(shù)×100%。

1.2.2 AMF分離 取風干土樣20 g，放入大燒杯中加500 mL清水攪拌均勻，浸泡40 min后過雙層分樣篩（上層20目，下層400目）。反復洗篩土樣，收集下層篩子上的殘留物于大號離心管中，在離心機中以1 500 ×g離心3 min；去掉上清液后加入濃度45%蔗糖溶液，攪拌均勻后快速放入離心機，以400 ×g離心2 min后迅速將上清液過400目篩，用清水清洗掉糖液后將篩中孢子收集到培養(yǎng)皿中置于解剖鏡下計數(shù)，計算樣品孢子密度（個/20 g土樣）。

1.2.3 AMF鑒定 將分離取得的孢子，用水做浮載劑、加Melzer's染液制片，于光學顯微鏡下觀察孢子的形狀、顏色、孢壁顏色、壁層結構、組成、孢子內(nèi)含物等，測量孢子的大小、孢壁厚度。于OLYMPUS BX51TRF生物攝影顯微鏡下拍照。參照最新分類系統(tǒng)[8]和國際叢枝菌根真菌菌種保藏中心（INVAM，http：//invam.caf.wvu.edu）提供的種的描述和圖片，王幼珊[9]著《中國叢枝菌根真菌資源與種植資源》中AMF種的描述與國內(nèi)相關文獻進行種類鑒定。

2 結果與分析

2.1 不同紅樹植物根部AMF的侵染

對八門灣八種紅樹植物根樣進行染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)其根部有AMF，根部可見清晰的菌絲、侵入點、泡囊等結構（圖1）。所采集根樣均被AMF侵染，但侵染程度各有不同。從宿主種類來看，海桑>銀葉樹>海南海桑>木果楝>正紅樹>海蓮>木欖>白骨壤；從采樣時間來看，2013年5月所采集土壤樣品中孢子密度明顯大于2012年10月所采集樣品中孢子的密度，表明紅樹植物根際AMF孢子數(shù)量隨季節(jié)交替存在周期性變化（表2）。

2.2 AMF物種多樣性

2.2.1 AMF的種類及分布 對8種紅樹根際土壤樣品中AMF孢子進行分離、鑒定，初步確定有4屬（Acaulospora、Gigaspora、Glomus、Fuscutata）16種AMF，其中Fuscutata savannicola為中國新記錄種。各種AMF分布情況如表3所示。

從表3中可看出，在已鑒定出的菌根真菌中，海桑根際的AMF種類最多，有Acaulospora、Gigaspora、Glomus、Fuscutata 4屬共11種，其次是海蓮有Acaulospora、Gigaspora、Glomus 3屬共8種。正紅樹及白骨壤種類最少，分別僅有1屬1種。球囊霉屬種類最多，有7個種，其次是無梗囊霉屬有6個種。

2.2.2 已鑒定的AMF記述

（1）細齒無梗囊霉Acaulospora denticulata Sieverding & Toro，1987（圖3-A）：孢子球形或近球形，直徑125～170 μm，黃色至黃棕色。孢子壁兩層（L1/L2），L1黃色至黃棕色，厚2～10 μm；L2透明，厚約1 μm；孢子壁在Melzer's 試劑中無明顯變化。孢子外壁可見多邊形或不規(guī)則形紋飾。標本號：HL-121110-02。樣本號：HL01。

（2）格擔無梗囊霉Acaulospora gedanensis J. Blaszkowki，1988：孢子球形、近球形或橢圓形，直徑50～90 μm，淺黃色至黃棕色，孢子內(nèi)的透明內(nèi)含物在Melzer's試劑中染色呈現(xiàn)出淺黃色。孢子壁兩層（L1/L2），L1黃色至黃棕色，厚2～7 μm；L2與L1緊貼，淡黃色，厚約2 μm；孢子壁在Melzer's試劑中無明顯變化。孢子壁外有細小突起。標本號HS-130614-06。樣本號：HL02、HS02。

（3）光壁無梗囊霉Acaulospora laevis J. W. Gerdemann & J. M. Trappe，1974：孢子球形或近球形，直徑100-200 μm，黃色至淺棕色，表面光滑。孢子壁三層（L1/L2/L3），L1光滑，厚1～2 μm；L2黃色至黃棕色，厚2～5 μm；L3無色，厚約2 μm；孢子壁在Melzer's試劑中無明顯變化。標本號HS-130614-17。樣本號：HS02、HNHS02、MGL01。

（4）波蘭無梗囊霉Acaulospora polonica J. Blaszkowski，1988.：孢子球形或近球形，直徑80-250 μm，透明至白色。孢子壁兩層（L1/L2），L1無色透明，厚約0.5 μm，易脫落；L2無色透明，厚約1.5 μm；孢子壁在Melzer's 試劑中無明顯變化。標本號：HS-130614-13。樣本號：HS02。

（5）細凹無梗囊霉Acaulospora scrobiculata J. M. Trappe，1977（圖3-B）：孢子球形或近球形，直徑80～150 μm，淡黃色至黃褐色，孢子表面密布圓形、卵圓形或多角形的凹坑紋飾。孢子壁三層（L1/L2/L3），L1無色透明，厚約1 μm；L2淡黃色至黃褐色，厚4～6 μm，在Melzer's 試劑中呈淺黃色；L3與L2緊貼，無色透明，厚約1 μm。標本號：HS-121226-04。樣本號：HS01、YYS02。

（6）刺無梗囊霉Acaulospora spinosa C. Walker & J.M. Trappe，1981（圖3-C）：孢子球形或近球形，直徑90～180 μm，淺黃色至黃棕色，孢子表面布滿針狀刺突，高約1～5 μm。孢子壁單層，厚2～5 μm，在Melzer's試劑中無明顯變化。標本號：HS-130613-21。樣本號：HS02。

（7）極大巨孢囊霉Gigaspora gigantean（Nicol. & Gerd.）J. W. Gerdemaxm & J. M. Trappe，1974（圖3-D）：孢子球形或近球形，黃綠色，表面光滑（170～300）μm×（200～350）μm。內(nèi)含顆粒狀物。孢子壁三層（L1/L2/L3），L1淡黃色，厚2.5～3.5 μm；L2黃綠色，厚5～25 μm，在Melzer's試劑中呈紫紅色；L3與L2緊貼，顏色相同，厚約1 μm。產(chǎn)孢細胞大?。?0～35）×（22～36）μm，淡黃色。標本號：HS-130613-19。樣本號：HL01，HS02。

（8）分支巨孢囊霉Gigaspora ramisporoaphora J.L.Spain，E.Sieverding & N.C.Sehenek，1989（圖3-E）：孢子球形或近球形，大?。?50～350）μm×（250～400）μm，黃色至黃棕色。內(nèi)含顆粒狀物。孢子壁三層（L1/L2/L3），L1無色透明，厚2～4 μm；L2黃色至黃棕色，厚5～10 μm，在Melzer's 試劑中呈紫紅色；L3與L2顏色相同，厚約1 μm，有小突起紋飾。產(chǎn)孢細胞大?。?0～55）μm×（35～65）μm，淡黃色。標本號：MGL-121127-03。樣本號：HL01、HS02、MGL01。

（9）棒孢球囊霉Glomus clavisporum（Trappe）R.T.Almeida&N.C.Schenck，1990（圖3-F）：孢子橢圓形或卵圓形，黃棕色至暗棕色，大?。?0～90）μm×（60～130）μm。孢壁單層，厚度均勻，光滑，黃棕色至暗棕色，厚2～5 μm，在Melzer's試劑中無明顯變化。連孢菌絲黃色至黃棕色，連點呈漏斗狀，不封閉。標本號：YYS-121203-02。樣本號：HL01、YYS01、HNHS01、ML01。

（10）德里球囊霉Glomus delhiense Mukerji，Bhattacharjee & Tewari，1983（圖3-G）：孢子球形或近球形，直徑90～130 μm，黃褐色，孢子表面粗糙，內(nèi)含顆粒狀物。孢子壁兩層（L1/L2），L1黃褐色，是層狀壁，有孔道，靠L2端有橫坎，厚3～8 μm；L2無色，可見向內(nèi)的斑點突起，厚2～3 μm。連孢菌絲延伸段扭曲，連點直筒狀。在Melzer's試劑中呈紅褐色。標本號：HL-130629-06。樣本號：HL02、HS02、BGR02。

（11）長孢球囊霉Glomus dolichosporum M. Q.Zhang，Y.S.Wang&L.J.Xing，199：孢子倒卵形、橢圓形或長橢圓形，大?。?0～100）μm×（100～170）μm，黃棕色至紅棕色。孢子壁二層（Ll/L2），L1黃色或黃棕色，厚度較均勻，厚3～9 μm；L2黃色至黃棕色，層狀，厚1～3 μm。菌絲連點圓柱形或者近漏斗狀，連點處有隔或無隔。標本號：YYS-130629-03。樣本號：YYS02。

（12）象牙白球囊霉Glomus eburneum L. J. Kennedy，J.C.Stutz，J.B. Morton，1999：孢子球形或近球形，直徑50～130 μm，透明至淡黃白色。孢子壁兩層（L1/L2），L1無色透明，厚1～2 μm；L2透明至淺黃色，孢子壓碎易皺縮，厚2～3 μm。連孢菌絲無色透明，有隔。標本號：HS-130614-03。樣本號：HL01，HS02。

（13）小果球囊霉Glomus microcarpum L. R. Tul.&C.Tul.，Giorn，1845（圖3-H）：孢子聚生在土壤中，球形或近球形，直徑20～60 μm，淡黃色至黃棕色。孢子壁單層，較光滑，厚2～6 μm，連孢菌絲寬5～7 μm，連點不封閉。在Melzer's試劑中染色無明顯變化。標本號：HNHS-130620-05。 樣本號：HNHS02。

（14）懸鉤子球囊霉Glomus rubiforme（Gerd. & Trappe）R.T.Almeida&N.C.Schenck，1990（圖3-I）：孢子聚生在土壤中，倒卵形或橢圓形，大?。?5～50）μm×（30～80）μm，黃色至黃棕色。孢子壁單層，較光滑，厚1～6 μm，連孢菌絲寬5～9 μm。在Melzer's試劑中無明顯變化。標本號：YYS-130624-01。樣本號：HL02、HS02、ZHS02、ML02、YYS02。

（15）彎絲球囊霉Gtomus sinuosum（Gerd. & B. K. Bakshi）R.T.Almeida&N.C.Schenck，1990：孢子倒卵形或橢圓形，大?。?5～60）μm×（50～100）μm，黃色至黃褐色。孢子壁單層，厚3～8 μm，通常孢子的內(nèi)壁可見向內(nèi)的棒狀突起，壁上有輻射狀小溝，基部有一小孔通向連孢菌絲，連孢菌絲寬6～10 μm。在Melzer's試劑中無明顯變化。標本號：YYS-130629-06。樣本號：ML02、YYS02。

（16）Fuscutata savannicola（R.A.Herrera&Ferrer）Oehl，F(xiàn).A.Souza & Sieverd.，comb. nov. Basionym：Scutellospora savannicola（R.A.Herrera&Ferrer）C.Walker & F.E.Sanders，1986[10]（圖4）：孢子果未知。孢子土中單生，端生或側生于產(chǎn)孢細胞上。孢子透明至白色，卵形至橢圓形，孢子大?。?80～580）μm×（210～370）μm；產(chǎn)孢細胞鱗莖狀，透明至淺黃色，大小33～51 μm。孢壁三組（外壁Ow、中壁Mw、內(nèi)壁Iw）：Ow三層（L1/L2/L3），均無色透明，表面光滑無特異性紋飾；Mw二層（L1/L2），無色透明；Iw二層（L1/L2），無色透明，L1上具發(fā)芽盾室。Melzer's中Mw、Iw-L2呈紫紅色。發(fā)芽盾室淺黃棕色至棕色，雙裂葉，橢圓形至心形，具4條蝌蚪紋，大小（100～160）μm×（90～140）μm，具有兩個芽管萌發(fā)位點。

該種AMF孢子在形態(tài)、大小等特征方面極易與原三紅盾巨孢囊霉（Fuscutata trirubiginopa）混淆。但是該種孢子上發(fā)芽盾室具有4個顯著的蝌蚪形裂痕，且Melzer's染色處理后Fuscutata trirubiginopa的Ow-L2、Mw、Iw-L2均呈淺紫紅色至深紫紅色，而Fuscutata savannicola僅Mw、Iw-L2有染色反應。標本號：HS-20130613-10。樣本號：HS02。

3 討論

3.1 AMF孢子密度季節(jié)性變化

目前，關于AMF孢子動態(tài)變化的研究較少，研究成果較為零亂。李凌飛等[11]認為AMF的孢子密度和物種豐富度在冬季最高而春、夏、秋相對較低，主要因為宿主植物在冬季時生長和光合作用減緩或停止，光合產(chǎn)物減少，而大多數(shù)無性繁殖的真菌在營養(yǎng)不良時會產(chǎn)生大量的繁殖體（孢子）以渡過不適時期；同時，低溫、干燥的土壤環(huán)境也非常利于孢子的保存。海南島全年氣候不存在顯著差異，據(jù)報道紅樹植物在進入5月后生長較快，進入10月生長開始減慢，逐步進入休眠期[12]，這與孢子密度的周期性變化相一致。

3.2 AMF侵染率的差異

不同紅樹樹種根際菌絲侵染率不同，這可能與紅樹植物所處位置相關。紅樹植物發(fā)達的氧氣輸送機制為AMF的生長提供了可能，但處在不同位置的紅樹植物根際的實際氧含量卻不相同。海桑、海南海桑等的氣生根常處于半淹沒或未淹沒狀態(tài)，根部土質疏松，氣生根發(fā)達，攝氧量高，利于AMF的生長繁殖；海蓮、正紅樹、木欖在漲潮時氣生根則處于全淹沒狀態(tài)，攝氧量次之；白骨壤通常生長在離岸稍遠且高出海平面的土埂上，土質較為致密，相比之下攝氧量最少，這浸淹形成的攝氧量梯度與AMF侵染差異相一致。與Wang等[5]對深圳福田紅樹林叢枝菌根研究中的獲得的結果相同。。

3.3 紅樹植物根際AMF物種多樣性

本次調查初步確定16種AMF，其中球囊霉屬和無梗囊霉屬為優(yōu)勢屬。同時，首次在紅樹植物根際分離到巨孢囊霉目（Gigasporale）中2屬真菌，其中Fuscutata savannicola為國內(nèi)新記錄種，進一步豐富了紅樹植物根際AMF的物種多樣性。此外，已鑒定AMF中有15種均已見于梁昌聰、石兆勇、高秀兵、邵金誠、蓋京萍等的報道[13-19]，表明海南植物根際土壤中AMF種類存在一定的相似性。從初期的研究結果來看，海南八門灣的紅樹植物根際具有較為豐富的菌根真菌資源，本文只對所鑒定出的菌根真菌種類進行了報道，尚有部分待鑒定的種類在進一步的研究中。

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