武發(fā)思 汪萬(wàn)福 賀東鵬 徐瑞紅 蘇伯民

內(nèi)容摘要：為了探明造成潮濕環(huán)境土遺址生物污損的主要藻類(lèi)類(lèi)群，給后期生物退化機(jī)理的研究和防治體系的構(gòu)建提供可靠依據(jù)，本研究采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)杭州良渚北城墻考古土遺址表面的藻類(lèi)進(jìn)行了檢測(cè)和分析。結(jié)果表明，引起土遺址生物污損的病害藻類(lèi)共3門(mén)5屬，主要為藍(lán)藻門(mén)念珠藻屬類(lèi)群，硅藻門(mén)菱形藻屬與褐指藻屬類(lèi)群次之，藍(lán)藻門(mén)殼藻屬與綠藻門(mén)的未鑒定屬最少。另外，苔蘚植物門(mén)蘚綱與薄囊蘚屬相近的類(lèi)群在部分樣品中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。光合藻類(lèi)與苔蘚類(lèi)群組成的不同主要受各采樣位點(diǎn)的空間位置和土體含水量的差異所影響。降低考古土遺址附存環(huán)境中的光照和滲水可以有效地控制有害光合生物體的滋生蔓延和侵蝕。

關(guān)鍵詞：土遺址；藻類(lèi)；苔蘚；克隆文庫(kù)；群落組成；潮濕環(huán)境

中圖分類(lèi)號(hào)：K854.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000-4106（2014）04-0114-07

一 引 言

藻類(lèi)是引起文物病害的常見(jiàn)生物類(lèi)型，它們對(duì)文物的生物退化作用主要表現(xiàn)在美學(xué)價(jià)值的降低和材料性質(zhì)的改變兩個(gè)方面。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻和綠藻在石質(zhì)文物的生物退化過(guò)程中扮演著先鋒入侵者的角色[1]。藻類(lèi)細(xì)胞增殖及色素積累引起的覆蓋通常稱(chēng)為生物污損，而因細(xì)胞生物活性作用導(dǎo)致材料分解的過(guò)程可稱(chēng)為生物風(fēng)化[2]。綠藻生物膜的形成促進(jìn)了材料表面對(duì)空氣中污染物的捕獲能力，導(dǎo)致文物逐漸變黑[3，4]。同時(shí)，藻類(lèi)可分泌大量的胞外聚合物，這種生物質(zhì)膠體在文化遺產(chǎn)材料孔隙內(nèi)的收縮與膨脹循環(huán)產(chǎn)生的機(jī)械力會(huì)進(jìn)一步造成材質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞[5]。不僅如此，文物表面的沉積物和藻類(lèi)固定的碳水化合物還可為其他異養(yǎng)微生物提供生長(zhǎng)基質(zhì)，加速材料的退化[6]。石質(zhì)文物表面深綠色和黑褐色的硬殼狀沉積物主要由藍(lán)藻、綠藻、其他微藻、真菌和地衣組成[7，8]。藻類(lèi)的生長(zhǎng)和增殖在很大程度上受制于溫度、濕度、光照等環(huán)境因子，潮濕環(huán)境下建筑材料的變綠程度與其表面溫度的變化呈負(fù)相關(guān)，另外，濕度水平和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)對(duì)于藻類(lèi)的生長(zhǎng)和增殖也發(fā)揮著重要作用[9]。

我國(guó)文物資源豐富，歷史建筑與考古遺址在中原、南方等地區(qū)的潮濕環(huán)境中分布廣泛。受土體的物質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)構(gòu)造及其他物理化學(xué)性質(zhì)的影響，土遺址本身就比較脆弱，在潮濕環(huán)境下更難以保存。近年來(lái)，我國(guó)文物保護(hù)工作者在潮濕環(huán)境土遺址原位加固材料的篩選[10]、“潮濕環(huán)境”范圍的界定[11，12]、保護(hù)理念的探索與技術(shù)的研發(fā)方面開(kāi)展了大量卓有成效的工作[13]，為南方地區(qū)大型土遺址的保護(hù)提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

潮濕環(huán)境下土遺址病害生物的檢測(cè)和鑒定至關(guān)重要，直接影響到對(duì)后期腐蝕退化過(guò)程的研究和防治措施的建立。然而，我國(guó)在遺產(chǎn)地生物病害的研究領(lǐng)域開(kāi)展的工作還較少，對(duì)于文物病害霉菌、藻類(lèi)與苔蘚的鑒定主要依賴(lài)于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)等手段[14]，現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)仍未能在病害生物類(lèi)型的檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[15]。本研究以良渚古城北城墻考古土遺址表面的病害藻類(lèi)為研究對(duì)象，旨在建立一種基于分子生物學(xué)技術(shù)的病害藻類(lèi)快速檢測(cè)方法，為準(zhǔn)確判定文化遺產(chǎn)地的病害藻類(lèi)的群落組成提供技術(shù)支撐。

二 材料與方法

2.1 取樣地簡(jiǎn)介

良渚遺址位于浙江省杭州市余杭區(qū)，年降水量在1150—1550mm之間。根據(jù)潮濕狀態(tài)下的土遺址分類(lèi)及定量化的參數(shù)指標(biāo)，該遺址地屬于典型的濕潤(rùn)區(qū)潮濕環(huán)境與潮濕狀態(tài)下的土遺址[11]。

本文中的研究樣點(diǎn)為良渚古城遺址北墻TG2，即北墻中段保存較好的地段，有4m×30m的南北向考古發(fā)掘探溝1條，發(fā)掘面積120m2（圖1-a）。探溝東壁的地層堆積可分為耕土層、近代層、灰褐色斑塊土和黃褐色粉沙土等12層[16]?，F(xiàn)場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，遺址主要存在著水的侵蝕、裂隙、根部掏蝕、生物污損等病害，保存難度很大，目前已經(jīng)采用搭建防雨棚等措施對(duì)土遺址進(jìn)行了初步的保護(hù)。

2.2 樣品采集

在“文物出土現(xiàn)場(chǎng)保護(hù)移動(dòng)實(shí)驗(yàn)室”基礎(chǔ)平臺(tái)的支持下，項(xiàng)目組于2012年7月首先開(kāi)展了研究樣點(diǎn)的生物病害的現(xiàn)狀調(diào)查，發(fā)現(xiàn)藻類(lèi)、苔蘚等光合生物已造成土遺址的大面積污染，考古文化層難以分辨。根據(jù)病害生物對(duì)考古土遺址造成污損顏色的差異選擇3個(gè)采樣位點(diǎn)（圖1-b），其中L1位點(diǎn)大致位于探溝底部深褐色土層，病害生物呈深銅綠色的不規(guī)則圓形或斑塊狀分布；L2位點(diǎn)污染面積最大，呈淺黃綠色粉末狀，覆蓋了多個(gè)考古文化層；L3位點(diǎn)大致位于黃褐色土層，主要表現(xiàn)為綠色污染。在各位點(diǎn)隨機(jī)選擇了3個(gè)取樣點(diǎn)，采用無(wú)菌解剖刀收集病害生物體，分別置于無(wú)菌Eppendorf管中，帶回實(shí)驗(yàn)室后用于樣品基因組總DNA的提取。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 基因組總DNA提取

使用PowerSoilTM（MOBIO Laboratories，Solanabeach，CA，USA）DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，分裝后置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 目標(biāo)片段擴(kuò)增

分別以樣品總DNA為擴(kuò)增模板，選擇CYA106F和CYA781R引物，擴(kuò)增藍(lán)藻16SrDNA基因[17]；選擇p23SrV_f1和p23SnewR引物，擴(kuò)增藻類(lèi)23SrDNA 質(zhì)體序列[18]。反應(yīng)體系（25μl）包括1U的Taq聚合酶，終濃度為0.2mM的dNTP，2.5μl10×反應(yīng)緩沖液，單條引物濃度0.2mM，2.0μl模板（約含10ng DNA）。CYA106F和CYA781R引物對(duì)的擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃5min，然后在94℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min，完成35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，終延伸72℃10min。p23SrV_f1和p23SnewR引物對(duì)的擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃2min，然后在94℃變性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，完成35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，終延伸72℃10min。所有擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段的大小與擴(kuò)增特異性。

2.3.3 克隆文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。取純化后產(chǎn)物3μl，與pGEM-T載體（Promega）連接，并克隆至E.coli DH-5α受體菌制備的感受態(tài)細(xì)胞中。根據(jù)藍(lán)白斑篩選固體培養(yǎng)平板（LB中AMP濃度為100μg/ml，X-Gal為60μg/ml，IPTG為20μg/ml），每一轉(zhuǎn)化平板挑取約50—100個(gè)白斑，用T7/SP6引物對(duì)直接擴(kuò)增驗(yàn)證插入片段大小。

2.3.4 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

將確定無(wú)誤后的陽(yáng)性克隆斑挑至液體LB試管中（含Amp 12μg/ml）37℃過(guò)夜培養(yǎng)，吸取1ml菌液送交測(cè)序公司完成序列測(cè)定（Shanghai Majorbio Bio-technology Co.， Ltd.）。所獲序列使用MEGA5.2軟件進(jìn)行編輯[19]，并在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLAST程序GenBank完成比對(duì)和相似序列的篩選，使用鄰接法（Neibor-Joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，靴值分析重復(fù)1000次。

三 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 克隆文庫(kù)序列

克隆文庫(kù)測(cè)序后，CYA106F和CYA781R引物對(duì)共得到序列115條（序列號(hào)：KF358576-

KF358690），利用BLAST程序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，克隆文庫(kù)中包含藍(lán)藻序列20條，其他藻類(lèi)序列12條，非藻類(lèi)序列83條，其中細(xì)菌序列4條，苔蘚植物葉

3.2 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析

在NCBI中利用BLAST程序比對(duì)所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的相似序列，選擇覆蓋度及相似度最高的1—2條作為參考序列，構(gòu)建CYA106F和CYA781R引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物16SrDNA及其相似序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖2）與引物p23SrV_f1和p23SnewR擴(kuò)增產(chǎn)物23SrDNA及其相似序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖3）。

3.3 病害生物群落組成

通過(guò)序列比對(duì)，確定L1位點(diǎn)樣品經(jīng)CYA106F和CYA781R引物對(duì)擴(kuò)增所得藻類(lèi)序列主要隸屬于念珠藻屬（Nostoc），并占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；經(jīng)p23SrV_f1和p23SnewR引物對(duì)擴(kuò)增藻類(lèi)序列主要隸屬于藍(lán)藻門(mén)（Cyanophyta）念珠藻屬，為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。L2位點(diǎn)樣品經(jīng)CYA106F和CYA781R引物擴(kuò)增所得序列全部為非藻類(lèi)序列，序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其主要與苔蘚植物門(mén)（Bryophyta）蘚綱（Hepatopsida）薄囊蘚屬（Leptobryum）類(lèi)群相近；p23SrV_f1和p23SnewR引物對(duì)未得到L2位點(diǎn)樣品擴(kuò)增產(chǎn)物。L3位點(diǎn)樣品經(jīng)CYA106F和CYA781R引物擴(kuò)增所得序列所屬門(mén)類(lèi)較多，其中苔蘚植物門(mén)薄囊蘚屬為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，硅藻門(mén)（Bacillariophyta）菱形藻屬（Nitzschia）與褐指藻屬（Phaeodactylum）次之，藍(lán)藻門(mén)殼藻屬（Microcoleus）及未鑒定細(xì)菌類(lèi)群最少；p23SrV_f1和p23SnewR引物擴(kuò)增產(chǎn)物序列主要為蘚綱薄囊蘚屬，其次為硅藻門(mén)菱形藻屬，藍(lán)藻門(mén)殼藻屬、念珠藻屬及綠藻門(mén)（Chlorophyta）未鑒定屬所占比例最少。

四 討 論

4.1 引物的特異性

本研究以良渚北城墻考古土遺址表面造成考古文化層覆蓋嚴(yán)重的綠色病害生物體為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)藍(lán)藻特異性引物和藻類(lèi)通用引物[17， 18]，重點(diǎn)研究造成土遺址病害的藻類(lèi)組成。本研究所選的兩個(gè)引物對(duì)在一定程度上均能實(shí)現(xiàn)潮濕環(huán)境中藻類(lèi)病害的快速檢測(cè)和初步的種屬鑒定。但是，這兩對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中包含大量的非藻類(lèi)序列，如L2及L3位點(diǎn)樣品中的苔蘚序列，這種非特異性擴(kuò)增不利于對(duì)樣品中藻類(lèi)群落結(jié)構(gòu)的整體水平的研究，但并不影響對(duì)遺產(chǎn)地病害藻類(lèi)的初步鑒定。苔蘚植物門(mén)葉綠體中16SrRNA也具有CYA106F和CYA781R的靶向擴(kuò)增位點(diǎn)，主要可能是因?yàn)樵孱?lèi)與陸生植物葉綠體的16SrRNA序列具有較高的同源性[20]。然而該引物還無(wú)法解決苔蘚植物科、屬、種之間進(jìn)化的問(wèn)題，在今后的研究中有必要引入葉綠體基因23SrRNA、rbcL、trnL、trnF以及細(xì)胞核基因ITS、18S和26SrRNA等，開(kāi)展各種苔蘚植物間及內(nèi)部系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究[21]。

4.2 主要病害類(lèi)群

比對(duì)克隆文庫(kù)所獲序列后發(fā)現(xiàn)：L1位點(diǎn)主要受到了藍(lán)藻門(mén)念珠藻屬的污損；L2位點(diǎn)主要為苔蘚植物門(mén)蘚綱植物覆蓋；L3位點(diǎn)的生物呈現(xiàn)出多樣性，藍(lán)藻、其他藻類(lèi)、苔蘚等均有出現(xiàn)。念珠藻為原核生物，沒(méi)有以核膜為界限的細(xì)胞核，藻體為多細(xì)胞的絲狀體，單一或多數(shù)藻絲在公共的膠質(zhì)被中。多數(shù)念珠藻可作食用，如發(fā)菜、葛仙米、螺旋藻等，有一些種類(lèi)是引起水體水華的主要種類(lèi)，具有重要的生態(tài)意義。念珠藻陸生種主要生長(zhǎng)在潮濕土表、巖山上，或混雜于蘚類(lèi)植物的莖葉間，有的可在表土下生活，它們也是造成考古遺址污損的主要類(lèi)群。在印度阿旃陀石窟的濕壁畫(huà)上、Bishnupur寺廟的陶器上以及其他考古遺址的表面，研究者發(fā)現(xiàn)造成遺址結(jié)痂的藻類(lèi)主要有16種，分屬于黏桿藻屬（Gloeothece）、黏囊藻屬（Myxosarcina）、念珠藻屬（Nostoc）、眉藻屬（Calothrix）等8個(gè)屬[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在潮濕環(huán)境或潮濕狀態(tài)下，良渚考古土遺址所處的自然環(huán)境條件與土體表面微生態(tài)環(huán)境都非常適宜念珠藻的生長(zhǎng)，也很容易造成土遺址的生物污損。苔蘚植物也多生長(zhǎng)于陰濕的環(huán)境里，常見(jiàn)于石面、泥土表面、樹(shù)干或枝條上。最新調(diào)查發(fā)現(xiàn)，位于印度錫布薩格爾市的阿洪王國(guó)考古遺址面臨著嚴(yán)重的苔蘚植物的入侵問(wèn)題，7種主要苔蘚對(duì)遺址的覆蓋率達(dá)15%[23]。我國(guó)學(xué)者通過(guò)對(duì)潮濕環(huán)境下的土遺址病害的分類(lèi)研究發(fā)現(xiàn)，杭州良渚遺址和南京大報(bào)恩寺遺址均存在苔蘚病害，不僅影響土遺址的原貌，而且還形成結(jié)皮層，增大遺址土的滲透性和儲(chǔ)水性，非常不利于土遺址的保存與保護(hù)[11]。本研究中各位點(diǎn)群落的組成差異主要是由其所處位置土體內(nèi)的水分含量所決定的。L1位點(diǎn)位于考古發(fā)掘探溝底部，受滲水影響，土體含水量最高，接近飽和；L3位點(diǎn)位于底部和發(fā)掘剖面的交匯地帶，土體潮濕；而L2位點(diǎn)在考古發(fā)掘的豎直剖面上，位置稍高，土體含水量最低。眾所周知，在植物界的演化進(jìn)程中，苔蘚植物本身代表著從水生逐漸過(guò)渡到陸生的類(lèi)型。本研究進(jìn)一步確定了造成良渚土遺址中植物損害的主要苔蘚類(lèi)群，同時(shí)發(fā)現(xiàn)原核藻類(lèi)藍(lán)藻、小型真核藻類(lèi)硅藻和綠藻均也是造成土遺址污損的重要因素。

4.3 防治措施

對(duì)于遺址地病害生物的防治措施是文物保護(hù)工作者最關(guān)心的問(wèn)題。化學(xué)殺滅作為一種便捷的手段，一直被大量采用，但這種措施所具有的環(huán)境高毒性、失效快、易篩選產(chǎn)生抗性菌株等不足仍然無(wú)法克服。法國(guó)拉斯科洞穴的史前壁畫(huà)曾因安裝人工連續(xù)照明系統(tǒng)而導(dǎo)致大量綠藻的入侵，并被迫于1963年停止對(duì)公眾開(kāi)放。洞穴管理方先后采用鏈霉素、青霉素、甲醛、生石灰、苯扎氯銨等來(lái)應(yīng)對(duì)不斷變化的微生物病害問(wèn)題，然而最新研究表明，被廣泛使用的季銨鹽類(lèi)生物殺滅劑苯扎氯銨（Benzalkonium Chloride，BC，又稱(chēng)潔爾滅）不僅對(duì)青枯菌（Ralstonia spp.）和假單胞菌（Pseudomonas spp.）無(wú)效，反而可被黑酵母（Black yeast）作為碳源代謝利用，加劇壁畫(huà)微生物病害的程度[24]。相比而言，一些新型的物理殺滅措施以其低成本、生態(tài)環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)而逐漸發(fā)展起來(lái)。如最近有研究稱(chēng)，使用60℃熱休克處理法可殺滅所有的供試驗(yàn)苔蘚植物，經(jīng)熱休克預(yù)處理后，便可用低于當(dāng)前有效殺滅劑10倍濃度的化學(xué)殺滅劑完全殺滅[25]。針對(duì)潮濕環(huán)境下的土遺址，有研究指出，導(dǎo)致潮濕環(huán)境下土遺址破壞的主要誘因依次是大氣降水沖刷、地下水位波動(dòng)和空氣濕度變化[12]，控制水環(huán)境的是解決潮濕環(huán)境土遺址保護(hù)的關(guān)鍵因素和先決條件[13]。另外，基于藻類(lèi)與苔蘚植物的光合自養(yǎng)特性，控制遺產(chǎn)地的光照也可以起到事半功倍的效果。潮濕環(huán)境土遺址表面的藻類(lèi)、地衣、苔蘚等病害生物的防治必須結(jié)合物理殺滅與清除、化學(xué)殺滅以及環(huán)境因子的控制等措施，以構(gòu)建綜合防治體系。

五 結(jié) 論

基于CYA106F/CYA781R和p23SrV_f1/p23

SnewR引物對(duì)的分子生物學(xué)技術(shù)可滿(mǎn)足遺產(chǎn)地多數(shù)病害藻類(lèi)的檢測(cè)及優(yōu)勢(shì)類(lèi)群的快速鑒定。

良渚北城墻考古遺址表面的病害生物主要為藍(lán)藻門(mén)念珠藻屬類(lèi)群和苔蘚植物門(mén)薄囊蘚屬類(lèi)群，硅藻門(mén)菱形藻屬與褐指藻屬類(lèi)群次之，藍(lán)藻門(mén)殼藻屬與綠藻門(mén)未鑒定屬所占比例最低。

各采樣位點(diǎn)的空間位置與土體含水量的差異成為光合藻類(lèi)與苔蘚類(lèi)群組成的決定因素。

致謝：浙江省文物考古研究所和良渚管委會(huì)人員在采樣過(guò)程給予了大力幫助，在此深表謝意！

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