何訪等

摘 要 利用染色體步移的方法克隆了一種白木香倍半萜合酶——愈創(chuàng)木烯合酶基因（AsSGS）791 bp的啟動(dòng)子序列，序列分析表明，獲得的序列中A/T含量達(dá)64.6%，與真核生物啟動(dòng)子序列的特征相符合。該序列除具有啟動(dòng)子核心序列TATA-box和增強(qiáng)子元件CAAT-box等典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件外，還含有如赤霉素反應(yīng)元件GARE-motif、ABA的應(yīng)答元件G-Box、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA-element和脫落酸響應(yīng)元件ABRE等參與激素調(diào)控元件，光應(yīng)答元件Box I、GA-motif、TCT-motif，熱脅迫反應(yīng)的HSE，厭氧誘導(dǎo)元件ARE和增強(qiáng)誘發(fā)厭氧反應(yīng)的GC-motif等順式作用元件。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本生煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)所獲得的啟動(dòng)子功能進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，所有缺失片段都能驅(qū)動(dòng)β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因表達(dá)，GUS活性與啟動(dòng)子片段的長(zhǎng)度呈正相關(guān)。

關(guān)鍵詞 白木香；倍半萜合酶；啟動(dòng)子；染色體步移；瞬時(shí)表達(dá)；β-葡萄糖苷酸酶

中圖分類號(hào) Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning and Function Analysis of the Sesquiterpene Guaiene

Synthase Gene（AsSGS）Promoter in Aquilaria sinensis

HE Fang1，2， MEI Wenli2， LI Huiliang2， GUO Dong2， PENG Shiqing2 *， DAI Haofu2 *

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Institute of Tropical Bioscience

and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract An approximately 791 bp genomic DNA fragment of AsSGS promoter from Aquilaria sinensis was cloned using Genome Walker strategy. Sequence analysis indicates that the content of A and T in the obtained sequence is 64.6%，which is correspond with the characteristics of eukaryotic promoter sequence. The sequence not only contain TATA box，CAAT-box and other core configurations，but also has several eukaryotic cis-regulatory elements，such as GARE-motif，G-Box，TGA-element，ABRE，Box I，GA-motif，TCA-motif，HSE，ARE and GC-motif. The functions of the obtained promoter were identified by using Agrobacterium-mediated transient expression system. GUS activity analysis revealed that all 5' deletions fragment of the AsSGS promoter could drive the expression of GUS gene in Nicotiana benthamiana plants. The GUS activity was positively correlated with the length of the promoter fragment.

Key words Aquilaria sinensis； Sesquiterpene synthases； Promoter； Genome walking； Transient expression； β-Glucuronidase

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.017

沉香是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬植物在受到傷害后產(chǎn)生的含有樹(shù)脂的木材[1]，是一種傳統(tǒng)的名貴藥材和天然香料，用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等[2]。健康的沉香屬植物并不產(chǎn)生沉香，只有通過(guò)自然因素（雷劈、火燒、蟲蛀等）或人為因素（砍傷、打洞、接菌等）的作用，沉香才會(huì)在植物中逐漸形成[2-3]。對(duì)于沉香的結(jié)香機(jī)制目前雖有一些假說(shuō)，但還缺乏科學(xué)依據(jù)[1]。白木香[Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg]是中國(guó)生產(chǎn)沉香的唯一植物資源，該植物是一種熱帶、亞熱帶常綠喬木，現(xiàn)已被列為國(guó)家二級(jí)瀕危保護(hù)植物，在中國(guó)海南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等?。▍^(qū)）均有分布[3]。

研究結(jié)果表明，倍半萜是沉香的主要特征性成分[4-7]，對(duì)倍半萜生物合成和表達(dá)調(diào)控的研究將有助于對(duì)沉香形成機(jī)制的理解。倍半萜的生物合成是由兩分子的異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）和一分子的二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）反應(yīng)生成法呢基焦磷酸（farnesyl-pyrophosphate synthase，F(xiàn)PP），然后FPP在倍半萜合酶的作用下合成相對(duì)應(yīng)的倍半萜[8-12]。愈創(chuàng)木烯合酶（Sesquiterpene guaiene synthases，SGS）催化FPP合成愈創(chuàng)木烯倍半萜類化合物。Kumeta等[13]克隆了Aquilaria crassna中的SGS基因，進(jìn)行相關(guān)的表達(dá)研究；Xu[14]等克隆了白木香愈創(chuàng)木烯合酶基因（Aquilaria sinensis Sesquiterpene guaiene synthases，AsSGS），分析了白木香樹(shù)受傷前后AsSGS的表達(dá)變化，但AsSGS的表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究利用染色體步移的方法克隆了AsSGS啟動(dòng)子并利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其功能進(jìn)行初步鑒定，這為進(jìn)一步研究AsSGS表達(dá)調(diào)控機(jī)制，闡明沉香的結(jié)香機(jī)制及倍半萜的生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

白木香樹(shù)干組織采集于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所區(qū)內(nèi)5年生白木香樹(shù)。本生煙草（Nicotiana benthamiana）種子、大腸桿菌（E. coli）DH5α、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株、pCAMBIA1381Z和pCAMBIA1301植物表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。用于構(gòu)建染色體步移文庫(kù)的試劑盒LA PCRTM in vitro Cloning Kit、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4連接酶、IPTG和X-gal等均購(gòu)于TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)于QIAGEN公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于Real-Times公司。

1.2 方法

1.2.1 染色體步移文庫(kù)的構(gòu)建 白木香DNA的提取參照趙翱等[15]的方法。染色體步移文庫(kù)的構(gòu)建按照TaKaRa公司LA PCRTM in vitro Cloning Kit使用說(shuō)明書進(jìn)行。使用5種產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶（Sau3AⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、MflⅠ、XbaⅠ）分別對(duì)白木香樹(shù)基因組DNA進(jìn)行酶切消化，并對(duì)酶切消化后的DNA進(jìn)行純化。然后把純化的DNA與試劑盒提供的接頭連接，構(gòu)建成5種染色體步移文庫(kù)（Sau3AⅠ庫(kù)、HindⅢ庫(kù)、EcoRⅠ庫(kù)、MflⅠ庫(kù)、XbaⅠ庫(kù)）。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)AsSGS的序列（GenBank登錄號(hào)：KC149961）設(shè)計(jì)2條反向巢式PCR特異引物S1（5′-CAGCAGAAGTTCCACAATCTGAGCCA

CC-3′）和S2（5′-CAAGAAGTTGGAAGA ATGA GTG

AGGA-3′）；試劑盒提供引物C1（5′-GTACATATTG

TGGTTAGAACGCGTAA TACGACTCA-3′）和C2（5′-GTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGG GAGA

-3′）作為正向引物進(jìn)行巢式PCR。

1.2.3 AsSGS啟動(dòng)子的分離 第1輪PCR反應(yīng)：在5個(gè)0.25 mL PCR管中分別加入5種DNA文庫(kù)0.5 μL，然后依次加入10×LA PCR 緩沖液Ⅱ 2 μL、2.5 mmol/L的dNTPs 2 μL，引物C1 1 μL，引物S1 1 μL、LA Taq 0.5 μL，補(bǔ)水至20 μL?；靹蚝笫紫仍?4 ℃預(yù)變性3 min，然后在94 ℃ 30 s，55 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。第2輪PCR反應(yīng)：分別取第1輪PCR產(chǎn)物1 μL稀釋500倍作為第2輪PCR反應(yīng)的模板，然后依次加入10×LA PCR緩沖液Ⅱ 2 μL、2.5 mmol/L的dNTPs 2 μlL，引物C2 1 μL，引物S2 1 μL、LA Taq 0.5 μL，總反應(yīng)體系為20 μL?；靹蚝筮M(jìn)行如下PCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性3 min，在 94 ℃ 30 s，58 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min 20 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物回收、純化后克隆到pMD19-T載體上并送北京諾賽生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 序列生物信息學(xué)分析 利用Neural Network Promoter Prediction在線對(duì)AsSGS基因的啟動(dòng)子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（http：//www.fruitfly.org/seq_

tools/promoter. html）；利用Plant CARE軟件（http：

//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和PLACE軟件（http：//www. dna.affrc. go.jp/PLACE/signalup.html）對(duì)分離的基因啟動(dòng)子的調(diào)控元件進(jìn)行在線分析。

1.2.5 AsSGS啟動(dòng)子的5′缺失體植物表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)已獲得的基因啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)引物，并將雙酶切位點(diǎn)引入不同長(zhǎng)度5′缺失的啟動(dòng)子。設(shè)計(jì)引物如下：

正向引物：P1：5′-atcggatccAGCTTTAATGCAG

CAAAACCAGCAGC-3′

P2：5′-atcggatccGAGCTTTAGAAG

TACAAAGTTGTTAC-3′

P3：5′-atcggatccCATTTGGATATCA

TCTACTAACCCAC-3'

P4：5′-atcggatccATTGAATTATTTT

CACCCAAACGTGT-3′

P5：5′-atcggatccGCAAGTGCGCTT

TCTAGTGCAGCCAT-3′

反向引物：R：5′-cggaagcttTTTTCTGTTCTTTT

GGTGCAAAAGCA-3′

PCR分別擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)不同大小的5′缺失啟動(dòng)子片段，并將它們分別克隆到PMD19-T載體上，測(cè)序驗(yàn)證。

選擇pCAMBIA1381Z作為瞬時(shí)表達(dá)載體，分別對(duì)表達(dá)載體和插入了缺失啟動(dòng)子片段的PMD19-T載體進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雙酶切效果。T4連接酶將表達(dá)載體和缺失片段連接起來(lái)，用載體引物PCR對(duì)構(gòu)建好的表達(dá)載體進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建好的植物載體如圖1。

1.2.6 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草 分別將驗(yàn)證好的5個(gè)重組質(zhì)粒、pCAMBIA1381Z和pCAMBIA1301質(zhì)粒用電融合法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中。30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，pCAMBIA1381Z載體引物PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。將驗(yàn)證正確的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加懸浮液（MES+MgCl2+AS）靜置2 h，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法轉(zhuǎn)化本生煙草，28 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.2.7 GUS染色和GUS活性檢測(cè) GUS染色：取3片轉(zhuǎn)化了表達(dá)載體的本生煙草，加入GUS蛋白染色液，24 h后用75%酒精進(jìn)行脫色。

GUS定量測(cè)定：取0.1 g煙草樣品用液氮磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，加入400 μL蛋白抽提緩沖液（50 mmoL/L磷酸緩沖液pH7.0、0.1% Triton X-100、0.1% SDS；10 mmoL/L β-巰基乙醇、10 mmoL/L Na2-EDTA），混勻，冰上靜置10 min，12 000 r/min離心10 min后吸取上清，此上清即為總蛋白提取液。采用Bradford[16]法測(cè)定總蛋白濃度，將總蛋白提取液與考馬斯亮藍(lán)溶液反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定其總蛋白濃度。采用Jeferson[17]法測(cè)定GUS蛋白活性，結(jié)果以所生成的4-MU的量與總蛋白含量和時(shí)間的比值pmol/mg·min表示。所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AsSGS啟動(dòng)子的克隆

通過(guò)2輪PCR擴(kuò)增后，在HindⅢ和EcoRⅠ 2個(gè)文庫(kù)中擴(kuò)增出清晰的條帶（圖2），將HindⅢ庫(kù)中擴(kuò)增獲得的較大片段克隆到載體后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果分析片段長(zhǎng)為902 bp，其中111 bp序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中AsSGS的翻譯起始位點(diǎn)下游的序列完全一致，表明克隆了791 bp的AsSGS啟動(dòng)子序列。序列分析表明獲得的序列中A/T含量高達(dá)64.6%，符合真核生物啟動(dòng)子序列的特征。

2.2 AsSGS啟動(dòng)子功能元件預(yù)測(cè)分析

對(duì)獲得的AsSGS啟動(dòng)子序列進(jìn)行功能元件預(yù)測(cè)分析表明，核心啟動(dòng)子區(qū)域位于-109～-60 bp，其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于翻譯起始位點(diǎn)上游69 bp處。采用Plant CARE數(shù)據(jù)庫(kù)和植物順式元件查詢數(shù)據(jù)庫(kù)PLACE（圖3），對(duì)AsSGS啟動(dòng)子的順式作用元件分析，結(jié)果顯示，該序列具有啟動(dòng)子核心序列TATA-box和增強(qiáng)子元件CAAT-box等多個(gè)典型的真核生物啟動(dòng)子基本元件。同時(shí)存在如赤霉素反應(yīng)元件GARE-motif，ABA的應(yīng)答元件G-Box和ABRE，生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA-element等參與激素調(diào)控的應(yīng)答元件。同時(shí)還存在光應(yīng)答元件BoxⅠ、GA-motif、TCT-motif，熱脅迫反應(yīng)的HSE；厭氧誘導(dǎo)元件ARE和增強(qiáng)誘發(fā)厭氧反應(yīng)的GC-motif等順式作用元件（表1）。

2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)對(duì)AsSGS啟動(dòng)子序列中順式作用元件分析結(jié)果設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得不同長(zhǎng)度的AsSGS啟動(dòng)子片段（791、633、511、298 bp和154 bp）。將這些片段克隆到pMD19-T載體上，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切的植物表達(dá)載體pCAMBIA1381Z連接，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，得到5個(gè)與預(yù)期大小一致的片段（圖4），并且對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明插入片段序列正確，植物表達(dá)載體構(gòu)建完成，分別命名為pC-P1、pC-P2、pC-P3、pC-P4和pC-P5。

2.4 AsSGS啟動(dòng)子功能初步鑒定

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體侵染本生煙草葉片，經(jīng)GUS蛋白染色發(fā)現(xiàn)，含有pC-P1、pC-P2、pC-P3、pC-P4和pC-P5植物載體的農(nóng)桿菌侵染的煙草葉片都顯藍(lán)色，陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA1301也顯藍(lán)色，陰性對(duì)照pCAMBIA1381Z不顯藍(lán)色，結(jié)果表明，所有片段都能驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)（圖5），-154 bp的P5片段可以驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)，說(shuō)明預(yù)測(cè)的核心啟動(dòng)子區(qū)域（-109～-60 bp）是正確的。

此外對(duì)含有pC-P1、pC-P2、pC-P3、pC-P4和pC-P5植物載體的農(nóng)桿菌侵染的煙草葉片進(jìn)行GUS蛋白活性定量分析，結(jié)果表明，所有缺失片段均具有活性。在缺失的啟動(dòng)子中，隨著啟動(dòng)子片段的大小的改變，GUS活性發(fā)生改變，GUS活性與啟動(dòng)子片段的長(zhǎng)度成正相關(guān)（圖6）。序列分析發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子上在-722～-718 bp、-606～-601 bp、-402～

-398 bp、-376～-371 bp、-208～-204 bp等處有增強(qiáng)子元件CAAT-box，這可能是導(dǎo)致片段越長(zhǎng)GUS活性越高的原因。但P4片段明顯高于P5片段，可能在-298～-155 bp區(qū)域有其他增強(qiáng)子元件，然而P3片段的活性又弱于P4片段，可能是在-511～-298 bp間存在抑制元件。

3 討論與結(jié)論

沉香作為名貴藥材和天然香料具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在自然條件下白木香結(jié)香時(shí)間很長(zhǎng)，且含量低，提高沉香的產(chǎn)量對(duì)發(fā)展沉香產(chǎn)業(yè)具有重要意義。目前對(duì)白木香和沉香研究主要集中在相關(guān)化學(xué)成分分析及藥理的研究，而缺乏對(duì)沉香的生物合成及調(diào)控機(jī)制的研究。

Kumeta等[13]證明了越南沉香（Aquilaria crassna）中的SGS基因表達(dá)受茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)；Xu[14]等發(fā)現(xiàn)傷害處理可以誘導(dǎo)AsSGS表達(dá)，但二者均未對(duì)SGS的表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。啟動(dòng)子是基因的一個(gè)重要組成部分，控制基因表達(dá)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度，對(duì)研究基因表達(dá)調(diào)控具有重要的作用[19-20]。本研究克隆了791 bp的AsSGS的啟動(dòng)子并進(jìn)行功能的初步分析，發(fā)現(xiàn)AsSGS啟動(dòng)子含有多種激素誘導(dǎo)應(yīng)答元件（如赤霉素反應(yīng)元件GARE-motif，ABA的應(yīng)答元件ABRE，生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA-element），表明AsSGS的表達(dá)受多種激素調(diào)控，這是首次對(duì)白木香在沉香形成關(guān)鍵基因AsSGS表達(dá)調(diào)控的相關(guān)報(bào)道。

通過(guò)改變植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來(lái)提高次生代謝物的產(chǎn)量已有報(bào)道，如在青蒿中過(guò)量表達(dá)法尼基焦磷酸合酶基因，青蒿素的含量與對(duì)照相比提高了4倍[21]；Daudonnet[22]等將來(lái)源酵母的法尼基焦磷酸合酶基因在煙草中超表達(dá)，固醇和胡蘿卜素的水平得到提高。如果在白木香樹(shù)中提高倍半萜合酶基因的表達(dá)量，就有可能提高白木香樹(shù)的倍半萜的量，從而提高沉香的產(chǎn)量。目前白木香樹(shù)的轉(zhuǎn)基因體系還不成熟，通過(guò)轉(zhuǎn)基因在白木香樹(shù)中過(guò)量表達(dá)倍半萜合酶基因還很困難。但通過(guò)對(duì)AsSGS的調(diào)控機(jī)制的深入研究，明確AsSGS的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，有可能通過(guò)激素或化學(xué)調(diào)控等方式調(diào)控AsSGS的表達(dá)。啟動(dòng)子活性、基因表達(dá)和基因產(chǎn)物三者之間有緊密關(guān)系。通過(guò)提高啟動(dòng)子的活性來(lái)增強(qiáng)倍半萜合酶基因的表達(dá)，產(chǎn)生更多的倍半萜合酶，最終增加倍半萜的產(chǎn)量，這為提高沉香的產(chǎn)量提供了可能。

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