昌莉麗 李華坤 劉桂蘭

摘要 [目的] 探討中西藥聯(lián)用對禽源大腸桿菌的體外抑菌效果。[方法]采用微量肉湯稀釋法測定2種臨床常用西藥（氟苯尼考、恩諾沙星）和4味中藥（黃連、黃芩、金銀花和板藍(lán)根）對大腸桿菌多重耐藥菌株的MIC值，探討2種西藥和4味中藥聯(lián)用對禽源大腸桿菌多重耐藥菌株的體外抑菌活性。[結(jié)果]6種藥物對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和多重耐藥菌株均具有抑菌活性。在8種中西藥聯(lián)用藥物組合中，氟苯尼考/黃芩、恩諾沙星/黃連、恩諾沙星/黃芩3組藥物組合聯(lián)用具有相加作用，其他5組中西藥物組合均呈現(xiàn)無關(guān)作用。[結(jié)論] 該研究可為進(jìn)一步篩選有效藥物組合防治禽大腸桿菌病提供重要指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 禽源大腸桿菌；中西藥聯(lián)用；MIC

中圖分類號(hào) S852.61+8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）16-05037-02

禽大腸桿菌病是養(yǎng)禽生產(chǎn)中最常見的疾病之一，只要飼養(yǎng)環(huán)境、氣候和營養(yǎng)等稍有變化，大腸桿菌病就容易流行，并常常和其他疾病，尤其是與禽流感并發(fā)混合感染。然而，由于大腸桿菌的血清型復(fù)雜，無法用疫苗進(jìn)行有效預(yù)防，臨床上只能依靠抗菌藥物來防治該病，在大量使用抗菌藥物的同時(shí)，也帶來了一系列問題，如耐藥性增加、藥物殘留等。另外，作為我國傳統(tǒng)資源的中藥來源廣、價(jià)格便宜，不僅具有抗菌消炎的作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留，但是因?yàn)橛昧看?、起效慢、療程長等缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用十分受限。因此，將中西藥結(jié)合起來防治禽源大腸桿菌病已成為解決目前防治大腸桿菌病難題的重要途徑之一?；诖?，筆者選擇多重耐藥菌株作為測試菌株，考察氟苯尼考、恩諾沙星與黃連、黃芩、金銀花、板藍(lán)根4味中藥聯(lián)用對禽源大腸桿菌多重耐藥菌株病的體外抑菌活性，以期為進(jìn)一步篩選有效藥物組合防治該地區(qū)禽大腸桿菌病提供重要指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥黃芩、黃芪、柴胡、金銀花、板藍(lán)根；抗菌藥氟苯尼考、恩諾沙星，均由瑞普天津生物技術(shù)有限公司研發(fā)部檢驗(yàn)合格后饋贈(zèng)。

藥敏質(zhì)控菌株ATCC25922，購于中國獸藥監(jiān)察所。臨床分離株來源于徐州市獸醫(yī)站畜禽門診部，經(jīng)剖檢初步診斷為大腸桿菌，摘取病死雞的肝、脾、輸卵管等部位，在麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)分離，對分離菌株經(jīng)革蘭氏染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生化反應(yīng)檢查，鑒定為大腸桿菌，在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)，膠塞密封保存，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

M.H肉湯培養(yǎng)基、96孔U型板、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，均由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備。

1.2.1.1 中藥藥液的制備。主要采取水提法，分別稱取黃連、黃芩、金銀花、板藍(lán)根5味藥材100 g，加入蒸餾水500 ml，浸泡2 h后，煮沸30 min，改文火煮1 h，紗布過濾，藥渣加水250 ml 繼續(xù)煮沸30 min，過濾，合并2次濾液，加熱濃縮至100 ml，最終獲得藥液含原藥材1 g/ml，置4 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 抗菌藥藥液的制備。精密稱取定氟苯尼考和恩諾沙星于容量瓶中，加入適量助溶劑溶解后，加入PBS液，最終制成濃度為1.28 mg/ml的藥液，微孔濾膜過濾后于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液制備。所選用的大腸桿菌為徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定，采用K.B紙片法藥敏試驗(yàn)篩選的多重耐藥菌株，營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基保存，取斜面上大腸桿菌菌落置于營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18 h，劃線接種于瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18 h，挑取單個(gè)菌落置于10 ml MH肉湯中培養(yǎng)18 h，配好后于4 ℃冰箱中保存。采用平板稀釋菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液含量，臨用前用滅菌肉湯稀釋成105 CFU/ml。

1.2.3 單藥MIC值的測定。采用微量肉湯稀釋法[1]測定4味中藥和2種抗菌藥對臨床分離大腸桿菌多重耐藥菌株的抑菌強(qiáng)度。取無菌96孔U型板，首先從第1孔到第12孔依次加入100 μl的菌液，第2步在第1孔加入100 μl的藥液，混合后吸取100 μl混合液至第2孔，再次混合，依此類推至第11孔，移取100 μl，棄去不用，第12孔作為菌液對照，微量震蕩器上振蕩1 min后，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)16～18 h后觀察，以肉眼未見細(xì)菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度。

1.2.4 中西藥聯(lián)用FIC值的測定。 采用微量肉湯棋盤稀釋法[1]測定4種中藥與2種抗菌藥物聯(lián)合的MIC值。取96孔U型板，以臨床分離多重耐藥菌株為測試菌株，每孔加入100 μl菌液，根據(jù)單藥MIC值的測定結(jié)果，以2MICA為最高濃度，吸取50μl沿96孔板橫軸依次倍比稀釋到1/16 MICA，以2 MICB為最高濃度，沿96孔板縱軸依次倍比稀釋1/16MICB，微量震蕩器上振蕩1 min，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h，測定2藥聯(lián)合時(shí)的MIC值。根據(jù)公式FIC值=（A藥聯(lián)合時(shí)的MIC值/A藥單測時(shí)的MIC值）+（B藥聯(lián)合時(shí)的MIC值/B藥單測時(shí)的MIC值）計(jì)算和判斷中西藥聯(lián)合應(yīng)用的效果。若FIC值<0.5，則表現(xiàn)為協(xié)同作用；若FIC值為0.5～1.0，則表現(xiàn)為相加作用；若FIC值為1.0～2.0，則為無關(guān)作用；若FIC值>2，則表現(xiàn)為拮抗作用。

2 結(jié)果分析

2.1 6種藥物對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離耐藥菌株的MIC值 由表1可知，6種藥物對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離耐藥菌株均有抑菌活性，其中4種清熱解毒類中藥抑菌活性以黃連MIC值最?。?5.625 mg/ml），抑菌活性最高，其次為黃芩和金銀花，板藍(lán)根居后（125.000 mg/ml），其中4種中藥對大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株和耐藥菌株在MIC值上幾乎無差異，說明中藥對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和耐藥菌株的療效無顯著差異；2種抗菌藥為目前臨床常用的氟苯尼考和恩諾沙星，結(jié)果表明恩諾沙星對大腸桿菌耐藥菌株的MIC值提高128倍，氟苯尼考對大腸桿菌耐藥菌株MIC值提高16倍，說明試驗(yàn)菌株對2種抗菌藥產(chǎn)生了較高的耐藥性。

2.2 中西藥聯(lián)用對臨床分離雞大腸桿菌耐藥菌株的FIC值 由表2可知，氟苯尼考/黃芩、恩諾沙星/黃芩、恩諾沙星/黃連藥物3種藥物組合呈現(xiàn)相加作用，聯(lián)合用藥后MIC值均較單獨(dú)用藥時(shí)有較大程度下降，尤其是恩諾沙星與黃芩、黃連聯(lián)合用藥后，其MIC值由原來單用時(shí)的0.080 mg/ml減少到聯(lián)用后的0.010 mg/ml，抗菌活性提高了8倍。恩諾沙星/金銀花、恩諾沙星/板藍(lán)根、氟苯尼考/黃連、氟苯尼考/金銀花、氟苯尼考/板藍(lán)根5種藥物組合表現(xiàn)為無關(guān)作用。

3 討論

氟苯尼考、恩諾沙星是目前臨床上（除頭孢類抗生素）防治禽源大腸桿菌的主要抗菌藥，關(guān)于大腸桿菌對頭孢類抗生素耐藥機(jī)制和聯(lián)合用藥報(bào)道較多，但對氟苯尼考、恩諾沙星的相關(guān)研究相對較少。耐藥性調(diào)查[2]結(jié)果表明隨著這2種藥物在臨床上的大量使用，大腸桿菌對氟苯尼考、恩諾沙星的耐藥性逐年增加，2種藥物的療效已大大降低。該試驗(yàn)中將氟苯尼考、恩諾沙星分別與清熱燥濕類中藥黃連、黃芩，清熱解毒類中藥板藍(lán)根、金銀花聯(lián)用，考察中西藥結(jié)合對耐藥大腸桿菌的抑菌活性，結(jié)果表明這6種藥物均對大腸桿菌有抑菌作用，4種中藥對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和耐藥株的抑菌活性無顯著差異，說明與西藥相比中藥對大腸桿菌耐藥菌株療效相對穩(wěn)定；在8對藥物組合抑菌試驗(yàn)中，僅氟苯尼考/黃芩、恩諾沙星/黃芩、恩諾沙星/黃連3對藥物組合表現(xiàn)相加作用，抑菌活性增強(qiáng)，其他均為無關(guān)作用。黃偉[3]報(bào)道氟苯尼考與黃芩聯(lián)用內(nèi)服給雞用藥，黃芩會(huì)加快氟苯尼考在體內(nèi)的吸收速度，加速氟苯尼考在雞體內(nèi)的消除速度，說明氟苯尼考與黃芩聯(lián)合用藥后不僅療效增加，而且起效快，藥殘減少，應(yīng)為非常理想的藥物組合。陳群等[4]以黃芩和黃連的提取物作為質(zhì)粒消除劑，對大腸桿菌多重耐藥菌株進(jìn)行了體外R質(zhì)粒消除試驗(yàn)，消除率達(dá)到22.57%，說明恩諾沙星與黃芩、黃連聯(lián)合用藥后，不僅抑菌活性提高，還可以有效抑制大腸桿菌的耐藥性。另外，中藥成分復(fù)雜，作用機(jī)理不同于抗生素，療效往往受中藥各成分間的協(xié)同和綜合作用影響，以西醫(yī)基礎(chǔ)為理論的體外抑菌活性試驗(yàn)僅能作為中西藥聯(lián)合作用的基礎(chǔ)研究[5]，并不能完全代表藥物體內(nèi)療效。該試驗(yàn)中表現(xiàn)無關(guān)作用的5對藥物組合在臨床實(shí)際用藥中普遍存在，并且還取得好的臨床療效。羅智勇等[6]對雙黃連配合氟苯尼考的臨床療效觀察，發(fā)現(xiàn)該組合對豬支原體、雞支原體、流感等均有較好療效?？偠灾?，中醫(yī)治病辨證施治，多用復(fù)方，中西藥結(jié)合依靠藥物間的協(xié)同作用通?？梢栽鰪?qiáng)抗菌效能，提高臨床療效。同時(shí)聯(lián)合用藥還可以防止和延緩耐藥性的產(chǎn)生[7]。

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責(zé)任編輯 黃小燕 責(zé)任校對 李巖