蔣小紅 黃嬛

摘要 [目的]研究二氫卟吩e6（Ce6）載藥膠團(tuán)的體外光動(dòng)力療法（PDT）對(duì)子宮頸癌Hela細(xì)胞的殺傷作用。[方法]合成殼聚糖硬脂酸聚合物二氫卟吩e6載藥膠團(tuán)（CSO-SA/Ce6）和葉酸修飾聚合物的二氫卟吩e6載藥膠團(tuán)（FA-CSO-SA/Ce6）后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察載藥膠團(tuán)對(duì)細(xì)胞的毒性。以游離的Ce6、殼聚糖硬脂酸聚合物（CSO-SA）為對(duì)照組，應(yīng)用MTT法檢測(cè)Ce6載藥膠團(tuán)對(duì)Hela細(xì)胞的毒性作用；同時(shí)采用波長(zhǎng)630 nm的半導(dǎo)體激光垂直照射到24孔培養(yǎng)板上，照射時(shí)間為180 s/孔，繼續(xù)孵育細(xì)胞24 h，應(yīng)用MTT法檢測(cè)載藥膠團(tuán)在光照條件下對(duì)Hela細(xì)胞的光動(dòng)力殺傷效率。[結(jié)果]熒光顯微鏡顯示，Ce6載藥膠團(tuán)不影響細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)，對(duì)Hela細(xì)胞毒性較??；MTT法表明，Ce6包載后，對(duì)Hela細(xì)胞的PDT殺傷作用顯著強(qiáng)于Ce6。[結(jié)論]Ce6載藥膠團(tuán)對(duì)Hela細(xì)胞具有良好的光動(dòng)力殺傷作用，且PDT殺傷效率優(yōu)于Ce6。

關(guān)鍵詞 二氫卟吩 e6；載藥體系；光動(dòng)力療法；制備

中圖分類號(hào) S859 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）16-05034-03

光動(dòng)力學(xué)治療 （photodynamict therapy，PDT） 是20世紀(jì)80年代初興起并在近年迅速發(fā)展的新穎治療腫瘤的方法，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。光動(dòng)力學(xué)療法具有毒性小、收效快、靶向性強(qiáng)的特點(diǎn)，在殺傷增殖細(xì)胞的同時(shí)不危及正常組織[1-2]。通過(guò)生物光動(dòng)力敏化作用，即在特定波長(zhǎng)的激光照射后，光敏劑受到激發(fā)，由基態(tài)（S0）經(jīng)激發(fā)單線態(tài)（S1）轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)三線態(tài)（T1），然后由激發(fā)三線態(tài)（T1）使周圍介質(zhì)中的分子氧成為單線態(tài)氧（1O2）等活性物質(zhì)，它們與生物分子中的氧化敏感基團(tuán)作用，導(dǎo)致其氧化失活，最終引起腫瘤細(xì)胞死亡而顯示其治療作用[3]。目前臨床上應(yīng)用的光動(dòng)力治癌藥物如血卟啉衍生物（HpD）、光敏素Ⅱ等均為成分復(fù)雜的卟啉混合制劑，存在著在紅光區(qū)的吸收系數(shù)小、有效光動(dòng)力效應(yīng)低、光毒反應(yīng)大及化學(xué)組成不定等缺點(diǎn)。而二氫卟吩 e6（Ce6） 是葉綠素穩(wěn)定降解產(chǎn)物中與生物活性聯(lián)系最廣的成分之一，且已成為光動(dòng)力治癌新藥研究中倍受矚目的研究對(duì)象。有報(bào)道表明，Ce6 具有兩親性能（親水性和親脂性），能產(chǎn)生良好的腫瘤/正常組織比率，且吸收波長(zhǎng)移到了紅光區(qū)（664 nm），單線態(tài)氧產(chǎn)率Ф△較高，對(duì)腫瘤的抑制率遠(yuǎn)好于HpD[4]。近年來(lái)，為了提高光敏劑在腫瘤細(xì)胞的濃度，許多研究組將第二代光敏劑負(fù)載在適當(dāng)?shù)妮d體上，制成脂質(zhì)體、納米粒、乳劑等，通過(guò)正常生理過(guò)程選擇性地運(yùn)送、積集至靶組織，大幅度提高光敏劑抗腫瘤活性，這對(duì)提高藥物治療作用、降低毒副作用具有十分重要的意義。Richter 等研究發(fā)現(xiàn)苯并卟啉衍生物單環(huán)酸A制成脂質(zhì)體，能介導(dǎo)藥物迅速地進(jìn)入組織[5]。Vargas 等將 meso-（對(duì)羥基苯）卜啉（p-THPP）制成 PLGA 納米粒，可明顯增強(qiáng)藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用[6]。

殼聚糖是一種具有低毒、高生物相容性、可體內(nèi)降解的陽(yáng)離子型載體材料。但小分子量的殼聚糖即殼寡糖（chitosan oligosaccharide， CSO），本身缺乏親脂性，不易被細(xì)胞攝取即較難透過(guò)細(xì)胞膜；考慮到生物膜主要為脂質(zhì)屏障，以脂溶性材料為主要組成成分的固體脂質(zhì)納米粒，具備較強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力。為此，設(shè)想將親水性多糖入核與脂溶性納米粒入膜的機(jī)理進(jìn)行組合設(shè)計(jì)，利用殼寡糖的氨基與硬脂酸的羧基進(jìn)行化學(xué)嫁接，形成陽(yáng)離子嫁接物，該嫁接物在水性介質(zhì)中形成內(nèi)部疏水、外部含親水性多糖分子的陽(yáng)離子嫁接物膠團(tuán)。該試驗(yàn)以碳二亞胺為交聯(lián)偶合劑對(duì)水溶性的低分子量殼聚糖進(jìn)行疏水性改造，制備得殼聚糖硬脂酸聚合物，將該聚合物分散于水中，可通過(guò)自聚集形成聚合物膠團(tuán)；以 Hela 細(xì)胞系為模型細(xì)胞，對(duì)殼聚糖硬脂酸聚合物載藥膠團(tuán)進(jìn)行細(xì)胞光動(dòng)力效應(yīng)研究，考察 Ce6 在被殼聚糖硬脂酸聚合物包載前后的體外光動(dòng)力效應(yīng)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑。碳二亞胺（1-Ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide， EDC， 美國(guó)Sigma 公司）、殼聚糖硬脂酸聚合物（stearic acid grafted chitosan oligosaccharide，CSO-SA，自制，氨基取代度為3.48%）、葉酸（folic acid， FA，美國(guó)Sigma 公司）、細(xì)胞培養(yǎng)基1640（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)08062502）、胎牛血清（fetal bovine serum， FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)080614）、四唑藍(lán)（3-（4，5-dimethyl-thiazol-2-yl）-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide， MTT， 美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)090318）、二氫卟吩 e6（chlorin e6， Ce6， 上海紅綠光敏劑有限公司，批號(hào)20080324），其他溶劑和試劑均為分析純。

1.1.2 細(xì)胞。子宮頸癌細(xì)胞（Henrietta Lacks，Hela，中科院上海細(xì)胞所）。

1.1.3 儀器。Millipore 超濾離心管（MWCO 10，000，USA）、Thermo 3110 型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司）、Olympus 71-22型熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、JD-1 型氦氖激光電源（南京來(lái)創(chuàng)激光科技有限公司）、USC-302 型超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備廠）、85-2 型恒溫磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器廠）、BS 110S型電子天平（上海天平儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 葉酸修飾殼聚糖硬脂酸聚合物的合成。采用碳二亞胺法[7]對(duì)CSO-SA進(jìn)行葉酸修飾。精密稱取CSO-SA 200 mg和葉酸（folic acid， FA）2.0 mg，加入100 ml蒸餾水探頭超聲使溶解，然后加入EDC 20 mg，維持90 °C水浴加熱， 攪拌5 h后停止加熱，待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后將其置于透析袋中（MWCO 3.5 KDa， Spectrum Laboratories， Laguna Hills， CA）透析48 h，以除去水溶性的小分子副產(chǎn)物，將透析液冷凍干燥，即得葉酸修飾的殼聚糖-硬脂酸聚合物（FA modified CSO-SA micelles， FA-CSO-SA）。

1.2.2 Ce6載藥膠團(tuán)制備。取一定量的 Ce6 醇溶液，與等體積的 CSO-SA 分散液混合，探頭超聲 20 次，制備載藥膠團(tuán)，用透析袋封裝溶液，在 500 ml 水溶液中于室溫下透析 24 h 除去乙醇，透析保留液即為 Ce6 載藥膠團(tuán)，凍干備用。

1.2.3 葉酸修飾聚合物的二氫卟吩e6載藥膠團(tuán)的制備。稱取葉酸修飾聚合物 FA-CSO-SA 10 mg，配制成5.0 g/L的FA-CSO-SA 水溶液，同時(shí)配制 0.5 g/L的Ce6 醇溶液。兩溶液等體積混合，冰浴探頭超聲20次，轉(zhuǎn)移至透析袋中，用去離子水于室溫下透析 24 h 除去乙醇。透析保留液即為 Ce6載藥膠團(tuán)（chlorin e6 loaded FA-CSO-SA micelles， FA-CSO-SA/Ce6），凍干備用。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)。取子宮頸癌細(xì)胞Hela在含有10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum， FBS）的 1640 培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)（5% CO2， 37 ℃孵箱）。用常規(guī)的胰酶/EDTA消化傳代。

1.2.5 載藥膠團(tuán)的細(xì)胞毒性。

1.2.5.1 載藥膠團(tuán)對(duì)細(xì)胞毒性的熒光顯微鏡觀察。將 Hela 細(xì)胞按 1.0 ×105個(gè)/（ml · 孔）接種于24孔培養(yǎng)板，置37 ℃，5%CO2 孵箱培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，加入 CSO-SA/Ce6，以未處理的空白細(xì)胞為對(duì)照，每孔設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板直接置于熒光倒置顯微鏡下，定時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.5.2 載藥膠團(tuán)對(duì)細(xì)胞毒性作用。采用四唑藍(lán)比色法[8]（MTT Assay）進(jìn)行細(xì)胞毒性研究。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 Hela 細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用含 10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的 1640 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為 1.0 ×105個(gè)/（ml·孔），接種于24孔培養(yǎng)板，每孔 1.0 ml，置 37 ℃，5%CO2 孵箱培養(yǎng) 24 h，待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度的 CSO-SA、Ce6 和 CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6，以未處理的空白細(xì)胞為對(duì)照，每孔設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔。正常 1640 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，然后加 60 μl MTT（5.0 g/L）溶液，置于 37 ℃，5%CO2 孵箱繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜 400 μl，振蕩 10 min，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定 570 nm 處吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，其公式為IC50 24 h= （Acontrol-Atreat）/Acontrol × 100%，式中，IC50 24 h表示24 h細(xì)胞增殖抑制率，Acontrol表示空白對(duì)照組吸光度，Atreat表示試驗(yàn)組吸光度。

1.2.5.3 載藥膠團(tuán)在光照條件下對(duì)細(xì)胞毒性作用。將培養(yǎng)的 Hela 細(xì)胞用 0.25%的胰蛋白酶消化，吹打，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)約 1.0 ×105個(gè)/（ml·孔）接種于 24 孔培養(yǎng)板，置于37 ℃含5% CO2 的孵育箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后棄去上清培養(yǎng)液，嚴(yán)格避光的條件下按試驗(yàn)設(shè)計(jì)加入不同濃度Ce6和CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6，在嚴(yán)格避光的條件下置于37 ℃含5% CO2的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)孵育4 h，然后照光。采用波長(zhǎng)630 nm的半導(dǎo)體激光進(jìn)行照射，使光束均勻地垂直照射到24 孔培養(yǎng)板上，照射時(shí)間為180 s/孔，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。照光后置于37 ℃含5% CO2的孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)孵育24 h，然后監(jiān)測(cè)細(xì)胞IC50。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，MTT法檢測(cè)的細(xì)胞毒性之間的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 載藥膠團(tuán)對(duì)細(xì)胞毒性的熒光顯微鏡觀察 以 Hela 細(xì)胞為模型，加入投藥量為 5%的 CSO-SA/Ce6，培養(yǎng)板在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。結(jié)果（圖1）顯示，加入載藥膠團(tuán)后，經(jīng)過(guò)24 h后細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)基本保持完好。

2.2 載藥膠團(tuán)對(duì)細(xì)胞毒性作用 采用四唑藍(lán)比色法（MTT Assay）進(jìn)行細(xì)胞毒性研究，考察 CSO-SA、Ce6、CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 在無(wú)光照條件下對(duì)Hela 細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示，在無(wú)光照存在的條件下，載體、Ce6、CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，這種毒性是無(wú)選擇性的，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)造成對(duì)正常細(xì)胞及系統(tǒng)的損害，而理想的光敏劑藥物則需要在無(wú)光照條件下，藥物的毒性越小越好。Ce6 在 CSO-SA 和 FA-CSO-SA 包載后，對(duì) Hela 細(xì)胞的24 h 半數(shù)致死量增加，IC50為89.72 mg/L，說(shuō)明載藥膠團(tuán)可以降低藥物的毒性。但CSO-SA/Ce6和FA-CSO-SA/Ce6對(duì)Hela 細(xì)胞的IC50 24 h則分別為 104.77和101.05 mg/L，沒(méi)有明顯差異。

2.3 載藥膠團(tuán)在光照條件下對(duì)細(xì)胞毒性作用

2.3.1 載藥膠團(tuán)在光照條件下對(duì)Hela 細(xì)胞毒性作用。 采用四唑藍(lán)比色法（MTT Assay）考察Ce6和CSO-SA/Ce6、FA-CSO-SA/Ce6 在光照條件下對(duì)Hela 細(xì)胞的毒性作用。光敏劑在受到一定波長(zhǎng)照射后，吸收光子能量，發(fā)生光敏化反應(yīng)，產(chǎn)生單線態(tài)氧或其他活性氧物質(zhì)，與多種生物大分子相互作用，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)或影響細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡，從而起到治療腫瘤的作用。研究表明，Ce6、CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 在630 nm、5 mA、照光180 s 的條件下，對(duì)Hela 細(xì)胞的毒性作用明顯增加，其光動(dòng)力細(xì)胞毒性PDT IC50分別為47.76、42.41和26.33 mg/L。

2.3.2 不同載藥膠團(tuán)的安全系數(shù)比較。采用細(xì)胞毒性IC50與光動(dòng)力細(xì)胞毒性PDT IC50之比，表示載藥膠團(tuán)的安全系數(shù)，此比值越大，表示載藥膠團(tuán)本身的毒性越小、光毒性越大，安全系數(shù)越大。結(jié)果（表1）顯示，CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 的安全系數(shù)分別達(dá) 2.11 和 3.84，光照后明顯提高載藥膠團(tuán)對(duì)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，說(shuō)明用極小的光敏劑量就可以達(dá)到很好的光動(dòng)力效應(yīng)，其本身的毒副作用隨之降低。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)利用殼聚糖-硬脂酸嫁接物具有兩親性特征，在水中自聚形成膠團(tuán)，以二氫卟吩e6為藥物模型，合成了殼聚糖硬脂酸聚合物二氫卟吩 e6 載藥膠團(tuán)（CSO-SA/Ce6）和葉酸修飾聚合物的二氫卟吩 e6 載藥膠團(tuán)（FA-CSO-SA/Ce6）；以Hela細(xì)胞系為模型細(xì)胞，采用熒光顯微鏡觀察載藥膠團(tuán)對(duì)細(xì)胞的毒性，采用四唑藍(lán)比色法（MTT Assay）從細(xì)胞水平探討了Ce6 載藥膠團(tuán)的細(xì)胞光動(dòng)力殺傷效應(yīng)，并與游離Ce6進(jìn)行了比較；采用波長(zhǎng)630 nm的半導(dǎo)體激光垂直照射到 24孔培養(yǎng)板上，照射時(shí)間為180 s/孔，繼續(xù)孵育細(xì)胞24 h，應(yīng)用MTT法檢測(cè)載藥膠團(tuán)在光照條件下對(duì) Hela 細(xì)胞的光動(dòng)力殺傷效率。結(jié)果顯示，在無(wú)光照條件下，Ce6 在 CSO-SA 和 FA-CSO-SA 包載后，對(duì) Hela細(xì)胞的24 h半數(shù)致死量增加，說(shuō)明載藥膠團(tuán)可以降低藥物的毒性；在光照條件下，Ce6、CSO-SA/Ce6 和 FA-CSO-SA/Ce6 對(duì) Hela 細(xì)胞的毒性作用明顯增加；FA-CSO-SA/Ce6 的安全系數(shù)最大，說(shuō)明用極小的光敏劑量就可以達(dá)到很好的光動(dòng)力效應(yīng)，其本身的毒副作用隨之降低。

光動(dòng)力效應(yīng)的強(qiáng)弱受光源、組織氧濃度、光敏劑種類、光敏劑濃度、光源能量密度等諸多因素的影響，選擇合適的條件是進(jìn)一步提高Ce6的光動(dòng)力學(xué)療效，降低毒性的必要保證，有待于今后試驗(yàn)的深入研究。

[1] OCHSNER M.Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of tumor tumor[J].Photochem Photobiol B，1997，39（1）：1-18.

[2] LEVY J G.Photodynamic therapy[J].Tibtech January，1995，13：14-18.

[3] 許德余.腫瘤光動(dòng)力療法[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥出版社，1996：7-28.

[4] PRIVALOV V A，LAPPA A V，SELIVERSTOV O V，et al.Clinical trials of a new chlorin photosensitizer for photodynamic therapy of malignant tumors[J].Proc SPIE，2002，4612：178-189.

[5] RICHTER A M，WATERFIELD E，JAIN A K，et al.Liposomal delivery of a photosensitizer benzoporphyin derivative monoacid ring A（BPD），to tumor tissue in a mouse tumor model[J].Photochem Photobiol，1993，57（6）：1000-1006.

[6] VARGAS A，PEGAZ B，DEBEFVE E，et al.Improved photodynamic activity of porphyrin loaded into nanoparticles：an in vivo evaluation using chick embryos[J].Int J Pharm，2004，286（1/2）：131-145.

[7] LIU S Q，WIRADHARMA N.Bio.functional micelles self.assembled from a folate.conjugated block copolymer for targeted intracellular delivery of anticancer drugs[J].Biomaterials，2007，28（7）：1423-1433.

[8] VERMA R S，GULLAPALLI S，ANTONY A C.Evidence that the hydrophobicuty of isolated，in situ，and de vivo.synthesized naove hurman placeotal folate receptors is a function of glycosyl.phosphatidylioositol anchonng to membranes[J].J Biol Chem，1992，267（6）：4119-4127.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2014，42（16）：5037-5038責(zé)任編輯 陳玉敏 責(zé)任校對(duì) 李巖