趙雪 呂春梅 韓英鵬 滕衛(wèi)麗 李文濱

摘要 [目的]探明大豆種質資源對大豆菌核病的耐受性（部分抗性）水平，挖掘耐病種質資源是選育抗病品種的前提和基礎。[方法]通過莖中可溶性色素法和離體葉柄接種法對130份大豆品種（系）進行抗/耐病性評價。[結果]2種方法的評價結果相關系數(shù)達到0.69，通過色素法鑒定得到耐病材料6份，中度耐病材料16份，通過葉柄接種法獲得高抗材料13份，囊括了色素法篩選得到的全部耐病材料和部分中耐材料。[結論]說明色素法作為一種間接鑒定方法，篩選標準較葉柄接種法更為嚴格和精準，適合大量種質資源的耐病性篩選。

關鍵詞 大豆；菌核病；莖中可溶性色素水平；耐病性

中圖分類號 S565.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05014-04

大豆菌核?。⊿clerotinia sclerotiorum）于1946年在加拿大安大略州首次被發(fā)現(xiàn)[1-2]，相繼在世界范圍內擴展傳播[3-5]。目前，大豆菌核病已成為僅次于大豆胞囊線蟲的第二大世界性病害[6]。該病原菌為核盤菌屬，在大豆苗期、成株期均可發(fā)病，嚴重時可致植株死亡，嚴重影響大豆產(chǎn)量[7]。在生產(chǎn)上，抗病品種的利用可以有效地降低該病害帶來的產(chǎn)量損失。篩選對大豆菌核病具有抗性的種質資源是選育抗病品種的前提和基礎。針對大豆種質資源的抗菌核病鑒定研究，國內外均有報道。早在1987年，Boland等[8]報道大豆種質資源中存在對菌核病的部分抗性即耐病性，大豆栽培種Maple Arrow為典型的部分抗性種質。我國大豆菌核病抗病資源篩選研究開始較晚，矯洪雙等[9]于1994年報道了大豆菌核病田間抗性鑒定，孫鮮鳳等[10]、王金生等[11]相繼報道了大豆菌核病抗性鑒定的研究，但多數(shù)研究所用的鑒定方式不盡相同。大豆菌核病抗性或部分抗性鑒定方法較多[12-16]，其中離體莖的可溶性色素法是一種快捷的鑒定手段，適合大量種質資源的篩選。筆者采用該方法對130份栽培大豆種質資源進行耐感性初評，并利用離體葉柄法結果與之比較，進一步確認鑒定結果的可行性和精準性，為大豆抗菌核病種質資源大量篩選工作提供支持，同時為抗病親本的選擇和優(yōu)異抗病基因的挖掘奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株。采集東北農業(yè)大學實驗實習基地大豆種植田中發(fā)病株的菌核，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基培養(yǎng)分離出菌絲，保存于培養(yǎng)基中備用。

1.1.2 供試大豆種質資源。供試材料包括生產(chǎn)推廣的大豆品種及優(yōu)良品系共130份（表1），感病對照品種為合豐25[17]，抗病對照品種為Maple Arrow[8]。

1.2 鑒定方法

1.2.1 莖中可溶性色素法及評價標準。莖中可溶性色素法（簡稱色素法）參考孫鮮鳳等[10]的方法，并在實施中加以改進。具體方法：將供試材料播種于溫室盆栽，12 h光暗交替，每份材料保苗 10 株。在第一復葉展開時期選取長勢一致的大豆植株，自子葉痕處剪斷，并剪去所有葉片，用濃度40 mmol/L草酸處理48 h后，測定試管中草酸溶液在 518 nm處的吸光值（OD518）。每份材料重復5次，取OD518平均值進行評價。

1.2.2 離體葉柄接種法及評價標準。用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)核盤菌，活化6 d后的菌絲體用于接種鑒定。接種和抗性分級參照矯洪雙等[15]的方法，略改進。在長寬高為70 cm×40 cm×15 cm的矩形塑料盒內鋪5 cm厚的蛭石，用滅菌蒸餾水完全浸潤后，將紗布鋪于上層，采集田間盛花期大豆植株生長點以下第4個節(jié)上生長的葉柄置于紗布上，接種直徑1 cm帶有核盤菌活化菌絲的瓊脂塊，敷保鮮膜保濕，放置在（25±2）℃、12 h光照環(huán)境下觀察其菌絲侵染情況。接種后以第7天莖腐長度作為評價基礎數(shù)據(jù)。將葉柄腐爛嚴重度記載標準規(guī)定為0～4級，分別為免疫、高抗、中抗、中感和感病類型。0級：接種處無明顯病斑；1級：接種處病斑長度1～3 cm；2級：接種處病斑長度在3～6 cm；3級：接種處病斑長度在6～8 cm；4級：接種處病斑長度在8 cm以上，病斑繞葉柄，并有黑色菌核產(chǎn)生[15]。

2 結果與分析

2.1 莖中可溶性色素法鑒定結果 參試的130份大豆種質資源莖中可溶性色素水平分布情況見圖1。頻數(shù)分布顯示，草酸處理后的供試材料在518 nm下的吸光值為0.001～0.058，其中耐病標準品種Maple Arrow的吸光值為0.058，為供試品種中的最大值，感病對照品種合豐25的吸光值為0.009，吸光值低于感病對照品種的材料占總體的54%，說明對菌核病敏感的品種在種質資源中占主體地位（圖1A）。

圖1B虛線指示吸光值的經(jīng)驗分布右尾分界線，0.05水平經(jīng)驗分布臨界值為0.048，說明吸光值高于該臨界值的材料耐病水平顯著高于其他材料。以此臨界值為標準，結合前人研究的耐病性劃分方法，進一步確定了較為合理的劃分標準（表2）。將供試材料按此標準進行劃分，篩選出感病材料71份（54.62%），中度感病材料37份（28.46%），中度耐病材料16份（12.31%）以及耐病材料6份（4.62%）（圖2）。

2.2 葉柄接種法鑒定結果 為了進一步證明莖中可溶性色素法對耐感性鑒定的準確性，利用離體葉柄接種法對參試材料進行了評價。葉柄腐爛長度為1.0～13.5 cm，與莖中可溶性色素水平整體呈現(xiàn)負相關關系，相關系數(shù)（R2）絕對值為0.69，根據(jù)相關顯著水平判斷標準（P<0.01，130樣本的R2臨界值為0.23），兩者達到極顯著相關關系，說明2種鑒定方法結果一致性較好（圖2）。

按照矯洪雙等[15]的5個級別的抗性劃分方法，將供試材料進行分類。整體而言，未篩選到完全免疫的類型，供試材料分布在除0級以外的4個級別中，其中高度感病類型（4級）材料居多，占總體的79.23%。篩選到抗病材料（1級）13個，占總體的10%，其余為中間過渡類型（圖3）。

圖3 色素測定法與葉柄接種法鑒定結果比較 通過葉柄接種法和色素測定法對抗/耐/感病類型劃分結果的比較發(fā)現(xiàn)，葉柄接種法鑒定為感?。?和4級）的材料中包含了色素測定法鑒定結果中的全部感病類型和絕大部分中度感病類型，而高抗類型（1級）則囊括了色素法鑒定出的全部耐病類型和吸光值相對較高的8個中度耐病類型（表3），由此說明2種方法對抗源的篩選和高度感病材料的鑒定具有較好的一致性和較高的效力。

3 結論與討論

我國作為栽培大豆的起源地，種質資源非常豐富，其中不乏優(yōu)異基因資源等待被挖掘和利用?？共≠Y源的篩選作為抗病品種選育和新基因發(fā)掘的基礎研究具有重要意義。針對菌核病的抗感性鑒定，國內外研究人員開發(fā)出包括室內和室外鑒定的多種方式以適應不同試驗的需要，然而多種方法建立的評價體系不盡相同使得同類研究難以進行平行比較[12-15]。

該研究利用2種室內鑒定方法對130份大豆種質資源進行菌核病耐病性進行評價和比較，其中莖中可溶性色素法是一種間接的鑒定手段[18-19]，它是建立在核盤菌的草酸發(fā)病機制基礎上[20]，通過植株對一定濃度草酸的耐受性模擬菌絲接種，具有較好的重復性[17]，試驗條件易于控制，該研究對耐病標準品種和感病對照品種的草酸耐受性評價結果與其他同類研究得到的結果基本一致，可以實現(xiàn)不同研究結果的平行比較和整合。

離體葉柄接種法作為一種直接接種方法，通過調查葉柄腐爛程度能夠較直觀地反映待測材料的抗感性水平，在該研究中作為色素法評價結果的驗證試驗，通過比較發(fā)現(xiàn)2種鑒定結果整體相關系數(shù)達0.69，同時對極端耐/感品種劃分的一致性說明2種方法對耐病資源的篩選均具可靠性和準確性。比較中間過渡類型材料的劃分結果，顯示出一定程度的不一致，說明2種方法在分辨中度耐/感類型材料方面存在局限性，需要在后續(xù)研究中對劃分標準進行合理優(yōu)化。另外，該研究發(fā)現(xiàn)品系DY2004-1在2種評價方法中出現(xiàn)相反的結果，即莖腐長度符合感病類型級別而莖中可溶性色素水平達到中度耐病級別，推測在菌核病抗病或耐病性方面可能存在其他機制，有待進一步研究。

該研究通過2種篩選方法獲得的6份耐病大豆種質中，Maple Arrow 為世界公認的加拿大耐病品種[14]，其余5份來自黑龍江和遼寧的耐病種質未見與前人研究結果的交叉，為該研究首次鑒定為耐病的種質，可作為大豆菌核病抗病育種的新資源加以利用。

參考文獻

[1] KOCH L M，HIDEBRAND A A.Soybean diseases in southwestern Ontario in 1946[J].Canadian Plant Disease Survey，1946，26：27-28.

[2] HILDEBRAND A A.Soybean diseases in Ontario[J].Soybean Digest，1948，10：16-17.

[3] GRAU C R，RADKE V L，GILLESPIE F L.Resistance of soybean cultivars to Sclerotinia sclerotiorum[J].Plant Disease，1982，66：506-508.

[4] CLINE M N，JACOBSEN B J.Methods for evaluating soybean cultivars for resistance to Sclerotinia sclerotiorum[J].Plant Disease，1983，67：784-786.

[5] BOLAND G J，HALL R.Growth room evaluation of soybean cultivars for resistance to Sclerotinta sclerotiorum[J].Canadian Journal of Plant Science，1986，66：559-564.

[6] WRATHER J A，ANDERSON T R，ARSYAD D M，et al.Soybean disease loss estimates for the top 10 soybean producing countries in 1994[J].Plant Disease，1997，81：107-110.

[7] 張波，王國慶，王桂華，等.大豆菌核病發(fā)病因素分析與防治方法[J].雜糧作物，2004，24（1）：48-49.

[8] BOLAND G L，HALL R.Evaluating soybean cultivars for resistance to Sclerotina sclerotiorum under field conditions[J].Plant Disease，1987，71：934-936.

[9] 矯洪雙，程志明，許修宏，等.大豆種質資源對菌核病的抗性鑒定研究[J].大豆科學，1994，13（4）：351-355.

[10] 孫鮮鳳，滕衛(wèi)麗，李冬梅，等.大豆新品種（系）的菌核病耐病性鑒定[J].大豆科學，2011，30（5）：834-837.

[11] 王金生，于安亮，徐鵬飛，等.栽培大豆種質資源對大豆茵核病的抗性評價[J].大豆科學，2009，28（6）：1054-1057.

[12] AULAIR J，BOLAND G J，KOHN L M，et a1.Genetic interactions between Glycine max and Sclerotinia scerotiorum using a straw inoculation method[J].Plant Disease，2004，88（8）：891-895.

[13] CHEN Y，WANG D.Two convenient methods to evaluate soybean for resistance to Sclerotinia sclerotiorum [J].Plant Disease，2005，89（12）：1268-1272.

[14] GRAU C R，RADKE V L.Effects of cuhivars and cultural practices on Sclerotinia stein rot of soybean[J].Plant Disease，1984，68（1）：56-58.

[15] 矯洪雙，程志明，許修宏，等.大豆對菌核病室內抗性鑒定方法研究[J].大豆科學，1996，15（4）：295-301.

[16] PENNYPACKER B W，HATLEY O E.Greenhouse technique for detection of physiological resistance to Sclerotinia sclerotiorum in soybean[J].Phytopathology，1995，85：1178.

[17] 孫明明，韓英鵬，陳浩，等.大豆菌核病鑒定方法比較及分析[J].大豆科學，2007，26（5）：728-731.

[18] KOLKMAN J M，KELLY J D.An indirect test using oxalate to determine physiological resistance to white mold in common bean[J].Crop Science，2000，40：281-285.

[19] LI D M，SUN M M，HAN Y P，et al.Identification of QTL underlying soluble pigment content in soybean stems related to resistance to soybean white mold （Sclerotinia sclerotiorum）[J].Euphytica，2010，172：49-57.

[20] FERRAR P H，WALKER J R.o-Diphenol oxidase inhibition-an additional role for oxalic acid in the phytopathogenic arsenal of Sclerotinia sclerotiorum and Sclerotium rolfsii[J].Physiological and Molecular Plant Pathology，1993，43（6）：415-422.