范淑芳

摘要 [目的]考察不同消毒方式對華中枸骨組織培養(yǎng)的影響。[方法]以華中枸骨的帶芽新梢莖段為外植體，分頂芽和側(cè)芽，研究乙醇、升汞的作用時間以及吐溫的用量對外植體消毒的影響。[結(jié)果]華中枸骨新梢頂芽的最佳消毒方式為：濃度75%乙醇作用50 s，濃度0.1%升汞作用6 min，Tween.80 1滴；側(cè)芽的最佳消毒方式為：濃度75%乙醇作用50 s，濃度0.1%升汞作用7 min。[結(jié)論]該方法優(yōu)化了華中枸骨組織培養(yǎng)的消毒方法，為華中枸骨的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 華中枸骨（Ilex centrochinensis）；組織培養(yǎng)；消毒方式

中圖分類號 S181.3 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）16-05007-02

華中枸骨（Ilex centrochinensis）為冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬（Ilex）植物，又稱針齒冬青或小果冬青。該植物壽命長，枝葉繁茂，莖枝形態(tài)多變且葉形奇特，葉上荊刺長短對稱，碧綠常青且黃花紅果，是一種應(yīng)用于建造庭院、樓臺美化、盆景造型、公園觀賞及寺廟仿古等的最佳天然植物材料之一；此外，該植物富含多種營養(yǎng)元素，可藥、茶兩用，且品質(zhì)優(yōu)良，是集觀賞與保健功能為一體的優(yōu)質(zhì)植物資源，故又被形象地稱為苦荊茶[1]。該植物種子繁殖與扦插繁殖均比較困難，其組培快繁的研究鮮有報道，嚴(yán)重限制了其推廣應(yīng)用。筆者主要針對帶芽新梢莖段的消毒方法展開系統(tǒng)地試驗，以期找到最佳的消毒方法，減少無菌系建立中的損失，為其組培快繁服務(wù)[2-4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。華中枸骨（Ilex centrochinensis），來源于湖北省黃岡市，于4月初采取長約5～10 cm、未木質(zhì)化的新梢莖段作為外植體。

1.1.2 主要試劑。所用試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒方法。將華中枸骨新梢修剪好后分頂芽和側(cè)芽各沖洗3遍、加洗衣粉水洗振蕩5 min、自來水沖洗1.5 h，再分別按表1正交設(shè)計表Lg（34）進行4因子3水平消毒處理，處理順序為：無菌水1遍，濃度75%乙醇，無菌水1遍，濃度0.1%升汞與吐溫同時加入，無菌水清洗5～6遍，每次3 min[5]。消毒后處理后每瓶豎接一個帶芽莖段，長約1 cm，頂芽每處理10瓶，重復(fù)3次，側(cè)芽每處理30瓶，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒時間的確定

2.1.1 頂芽消毒時間的確定。由表2可知，華中枸骨新梢頂芽的消毒處理中，消毒效果之間的差異達到極顯著（P<0.01），濃度75%乙醇40 s，濃度0.1%升汞5 min，Tween.80 1滴的消毒效果較好。而就后期生長而言，濃度75%乙醇50 s、濃度0.1%升汞6 min、Tween.80 1滴的消毒處理對芽的形成與生長作用較好；濃度75%乙醇30 s、濃度0.1%升汞5 min的消毒處理則對愈傷的形成與生長較好。

2.1.2 側(cè)芽消毒時間的確定。由表3可知，華中枸骨新梢側(cè)芽的消毒處理中，消毒效果之間的差異達到極顯著（P<0.01），75%乙醇50 s、0.1%升汞7 min的消毒效果較好；而就后期生長而言，75%乙醇50 s、0.1%升汞7 min的消毒處理對芽的形成與生長作用較好，75%乙醇40 s、0.1%升汞6 min的消毒處理則對愈傷的形成與生長較好。

2.1.3 外植體中頂芽與側(cè)芽的差異。由表2、3相比較可知，外植體中頂芽與側(cè)芽所確定的較好的消毒處理方法不一致，見圖1，側(cè)芽不同消毒處理效果的變化趨勢要較頂芽平緩，說明不同的消毒處理對頂芽的消毒作用較側(cè)芽強；頂芽培養(yǎng)1個月后芽的萌動率明顯高于側(cè)芽，其不同消毒處理之間的芽萌動率的差異見圖2，其最大可相差83.84%（消毒處理5），說明頂芽比側(cè)芽更易于誘導(dǎo)芽的發(fā)生；頂芽愈傷的萌動率則明顯低于側(cè)芽；無變化的側(cè)芽也比無變化的頂芽的比率大。綜合考慮，如果以帶芽莖段誘導(dǎo)不定芽的方式來進行華中枸骨的組織培養(yǎng)和快速繁殖，頂芽明顯比側(cè)芽好，應(yīng)優(yōu)先選擇新梢頂芽作為外植體。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，華中枸骨以帶芽的新梢莖段作為外植體進行消毒處理時，華中枸骨新梢頂芽的最佳消毒方式為：濃度75%乙醇作用50 s，濃度0.1%升汞作用6 min，Tween-80 1滴；側(cè)芽的最佳消毒方式為：濃度75%乙醇作用50 s，濃度0.1%升汞作用7 min。春季萌條中頂芽的芽萌動率明顯比側(cè)芽高，無變化的莖段所占的比例也比側(cè)芽低，消毒處理中的死亡率則比側(cè)芽高，可能原因為頂芽的生長勢較側(cè)芽強，且頂芽較側(cè)芽幼嫩。

參考文獻

[1] 李樹文.苦荊茶[J].特產(chǎn)研究，1991（1）：31，45.

[2] 肖顯華，王順珍，林榮雙，等.植物材料表面消毒方法的改進[J].生物技術(shù)，1999，9（1）：43-45.

[3] 王利民，周毅，陳龍友，等.植物組織培養(yǎng)中消毒劑的運用[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002，20（1）：15-17.

[4] 朱廣廉.植物組織培養(yǎng)中的外植體滅菌[J].植物生理學(xué)通訊，1996，32（6）：444-449.

[5] 孟玉玲，谷祝平.正交設(shè)計在誘導(dǎo)植物體細胞胚胎發(fā)生中的應(yīng)用[J].西北植物學(xué)報，1995，15（1）：10-15.