劉倫沛　劉立波　邵顯會(huì)　廖芳

摘要[目的]研究超聲波輔助提取銅錘玉帶草莖葉黃酮類(lèi)化合物的最優(yōu)工藝。[方法]以濃度70%乙醇為溶劑，采用超聲波作輔助提取設(shè)備，通過(guò)單因子試驗(yàn)確定影響黃酮類(lèi)化合物提取的主要因素及其最佳水平范圍，并通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)確定最優(yōu)提取條件。[結(jié)果]影響銅錘玉帶草莖葉黃酮類(lèi)化合物提取的因素主次為：超聲波功率>浸提溫度>提取時(shí)間>料液比；最優(yōu)工藝條件為：超聲波功率350 W，浸提溫度60 ℃，提取時(shí)間30 min，料液比1∶20（g/ml）；在該工藝條件下，銅錘玉帶草莖葉黃酮類(lèi)化合物的含量為38.437 mg/g。[結(jié)論]試驗(yàn)得出的最優(yōu)工藝條件可為銅錘玉帶草的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞銅錘玉帶草（Pratia begoniifolia Lindl.）；黃酮類(lèi)化合物； 超聲波； 提取工藝

中圖分類(lèi)號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）07-01933-03

基金項(xiàng)目凱里學(xué)院教授專(zhuān)項(xiàng)科研項(xiàng)目（JS201310）；貴州省重點(diǎn)支持學(xué)科——植物學(xué)建設(shè)項(xiàng)目（黔教高發(fā)〔2011〕275號(hào)）；凱里學(xué)院生物科學(xué)專(zhuān)業(yè)基礎(chǔ)課教學(xué)團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（JXTD201003）。

作者簡(jiǎn)介劉倫沛（1967-），男，貴州岑鞏人，教授，碩士，從事生物化學(xué)、植物生理學(xué)的教學(xué)及生物資源開(kāi)發(fā)與利用研究。

收稿日期20140210銅錘玉帶草（Pratia begoniifolia Lindl.）為桔?？沏~錘玉帶草屬（Pratia）多年生平臥草本植物，又名小銅錘、地鈕子、地石榴，主要分布于西南、華南、湖南、湖北、江西、浙江、福建、臺(tái)灣、越南和印度等地，大多野生于海拔300～2 300 m的丘陵、陰濕田坎、低山草坡或疏林中[1]。

銅錘玉帶草是我國(guó)民間一種重要中草藥，以全草入藥，具有利水消腫和解毒的功效，臨床用于治療急性腎炎、尿路感染和療瘡腫毒等。其果實(shí)味苦澀，性微溫，能補(bǔ)腎強(qiáng)精，用于遺精、白帶及小兒疳積等輔助治療。云南民間用全草治療風(fēng)濕疼痛、跌打損傷、乳癰和無(wú)名腫痛等[2-3]，佤族將其用于治療口腔潰爛癥[4-5]。經(jīng)生藥學(xué)鑒定和化學(xué)成分分析，銅錘玉帶草含有黃酮類(lèi)、酚類(lèi)、甾醇、氨基酸和高級(jí)脂肪酸酯等成分[6]，具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值。因其風(fēng)味獨(dú)特，是一種頗受人們青睞的野菜，現(xiàn)已逐漸成為賓館、酒店的時(shí)尚菜。近年來(lái)，人們對(duì)銅錘玉帶草進(jìn)行組織培養(yǎng)和人工種植，取得較好的經(jīng)濟(jì)效益[7-9]。另外，該植物對(duì)土壤適應(yīng)性比較強(qiáng)，具有耐旱、耐寒和抗病等特點(diǎn)，也成為一種園林地被植物。試驗(yàn)以銅錘玉帶草全草為材料，研究其黃酮類(lèi)化合物的提取工藝，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用銅錘玉帶草提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。銅錘玉帶草，于2013年8月15月采于貴州省丹寨縣韭菜溝老冬寨林場(chǎng)溪溝邊，標(biāo)本貯存于凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2主要儀器。RE52 A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；SHBⅢ 型循環(huán)水式真空泵，購(gòu)自河南省鞏義市英峪予華儀器廠；JYCCQ 超聲波萃取儀，購(gòu)自上海矩源機(jī)械設(shè)備有限公司；DS250 A型超聲波清洗器，購(gòu)自寧波市海曙達(dá)盛超聲波儀器廠；電熱恒溫真空干燥箱，購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；TU1800 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平，購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3主要試劑。蘆丁標(biāo)樣，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚（沸程30～60 ℃）、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純，市售。

1.2方法

1.2.1樣品的初處理。將采于貴州省丹寨縣銅錘玉帶草洗凈，涼干，置于70 ℃電熱恒溫真空干燥箱中烘干，搗碎并過(guò)40目篩，存放于干燥器中備用。

1.2.2提取工藝流程。銅錘玉帶草供試樣品→濃度70%乙醇浸泡12 h →超聲波輔助水浴加熱浸提→ 抽濾→濾液濃縮→定容50 ml→取5.00 ml作5倍稀釋?zhuān)ù郎y(cè)液）。

1.2.3線性關(guān)系的考察。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測(cè)定[10-14]。即準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng) 120 ℃干燥至恒重的無(wú)水蘆丁0.025 0 g，用濃度70%的乙醇溶解并定容至 100 ml，搖勻得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液 0、0.50、1.00、1.50、2.00和2.50 ml于10 ml干凈的比色管中，加入0.30 ml濃度5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置 6 min；然后加入0.30 ml濃度10%的硝酸鋁溶液，搖勻，靜置 6 min；再加入4.00 ml濃度4%的氫氧化鈉溶液，搖勻；最后用濃度70%乙醇溶液稀釋到刻度，搖勻后靜置15 min，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定510 nm處的吸光值（注：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液與銅錘玉帶草樣品總黃酮提取液經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色反應(yīng)后的掃描光譜得知，兩者在可見(jiàn)光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)均為510 nm），計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4黃酮類(lèi)化合物含量測(cè)定。吸取樣品提取待測(cè)液 1.00 ml，于10 ml干凈的比色管中，同“線性關(guān)系的考察”操作步驟，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定 510 nm處的吸光值，通過(guò)回歸方程計(jì)算樣品黃酮類(lèi)化合物的含量。2個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.2.5銅錘玉帶草黃酮類(lèi)化合物提取單因素試驗(yàn)。稱(chēng)取一定量的銅錘玉帶草供試樣品，按照提取工藝流程，選擇超聲波功率、乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比和浸提溫度等因素作單因子試驗(yàn)，提取液經(jīng)50 ml容量瓶定容，再作5倍稀釋?zhuān)?jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色，測(cè)定其510 nm處的吸光值，計(jì)算黃酮類(lèi)化合物含量，以此為指標(biāo)，考察各因素對(duì)銅錘玉帶草莖葉黃酮類(lèi)化合物提取的影響。（1）超聲波功率對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取的影響。分別稱(chēng)取供試樣品2.000 g，加入60 ml濃度70%乙醇，按照提取工藝流程，分別用200、250、300、350、400、450、500、550和600 W的超聲波在50 ℃水浴中輔助提取30 min，經(jīng)過(guò)濾、定容、稀釋和測(cè)定其吸光值，計(jì)算樣品中黃酮類(lèi)化合物的含量。（2）乙醇濃度對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取的影響。分別稱(chēng)取供試樣品2.000 g，按照提取工藝流程，分別用不同濃度的乙醇60 ml，在50 ℃水浴中用350 W的超聲波輔助提取30 min，經(jīng)過(guò)濾、定容、稀釋和測(cè)定其吸光值，計(jì)算樣品中黃酮類(lèi)化合物的含量。（3）提取時(shí)間對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取的影響。分別稱(chēng)取供試樣品2.000 g，加入60 ml濃度70%乙醇，按照提取工藝流程，在50 ℃水浴用350 W超聲波分別輔助提取10、20、30 、40、50和60 min，經(jīng)過(guò)濾、定容、稀釋和測(cè)定其吸光值，計(jì)算其黃酮類(lèi)化合物含量。（4）料液比對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取的影響。分別稱(chēng)取供試樣品2.000 g，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50（g/ml，W/V，下同）加入濃度70%乙醇，按照提取工藝流程，在50 ℃水浴用350 W超聲波輔助提取30 min，經(jīng)過(guò)濾、定容、稀釋和測(cè)定其吸光值，計(jì)算樣品中黃酮類(lèi)化合物含量。（5）浸提溫度對(duì)黃酮類(lèi)化合物提取的影響。分別稱(chēng)取供試樣品 2.000 g，加入60 ml濃度70%的乙醇，按照提取工藝流程，在不同的溫度條件下用350 W超聲波分別輔助浸提30 min，經(jīng)過(guò)濾、定容、稀釋和測(cè)定其吸光值，計(jì)算樣品中黃酮類(lèi)化合物的含量。

1.2.6銅錘玉帶草黃酮類(lèi)化合物提取正交試驗(yàn)。為進(jìn)一步研究超聲波輔助提取銅錘玉帶草黃酮類(lèi)化合物的優(yōu)化條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲波功率、料液比、浸提溫度和提取時(shí)間這4個(gè)因素，用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，提取其黃酮類(lèi)化合物，測(cè)定其510 nm處的光吸光值和計(jì)算黃酮含量。以黃酮類(lèi)化合物含量為考察指標(biāo)，全面研究這4個(gè)因素的交叉作用對(duì)其黃酮類(lèi)化合物提取的影響，各因素水平如表1所示。

2結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系的考察計(jì)算得線性回歸方程為：Y=0.008 71X+0.003 62，相關(guān)系數(shù)R為0.999 93。試驗(yàn)結(jié)果表明，在0～0.062 5 mg/ml范圍內(nèi)，蘆丁（黃酮）的質(zhì)量濃度在所配制的梯度范圍內(nèi)，吸光度與黃酮質(zhì)量濃度有很好的線性關(guān)系，即可按此法定量測(cè)定黃酮類(lèi)化合物。