謝麗

摘要 紫外可見分光光度計(jì)是對物質(zhì)進(jìn)行定量、定性、結(jié)構(gòu)分析以及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等研究的常用儀器，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。該文簡單解析了日立U-3900H型紫外可見分光光度計(jì)各功能模塊參數(shù)設(shè)置的方法。

關(guān)鍵詞 紫外可見分光光度計(jì)；功能模塊；參數(shù)設(shè)置

中圖分類號(hào) S237 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）26-09261-04

Analysis on Utilization of Function Modules of U-3900H UV Visible Spectrophotometer

XIE Li （School of Life Sciences， Lanzhou University， Lanzhou， Gansu 730000）

Abstract UV visible spectrophotometer is a common instrument used in quantitative and qualitative analysis， structure analysis and reaction kinetic study. It has been widely applied to each field of chemistry， medicine， pharmaceutical analysis， life science and environmental science etc. This paper introduces the parameters setting of function modules of Hitachi U-3900H UV visible spectrophotometer.

Key words UV visible spectrophotometer； Function modules； Parameters setting

自1918年第一臺(tái)紫外可見分光光度計(jì)問世以來，在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)、石油化工、藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、軍工等研究、生產(chǎn)和管理部門，已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用^[1-2]。隨著分光元件及技術(shù)、檢測器件及技術(shù)、大規(guī)模集成制造技術(shù)等的發(fā)展，以及微處理器、單片機(jī)和計(jì)算機(jī)技術(shù)廣泛應(yīng)用于分析儀器，使紫外可見分光光度計(jì)的性能指標(biāo)不斷提高，并且出現(xiàn)了自動(dòng)記錄、自動(dòng)打印、數(shù)字顯示、微機(jī)控制等使用上方便快捷的儀器產(chǎn)品^[1-3]。

蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心購置的U-3900H型紫外可見分光光度計(jì)是日立高新公司研制的一款雙光柵雙光束紫外可見分光光度計(jì)，其分析對象可從固體材料到液體材料，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。該機(jī)開機(jī)即啟動(dòng)對ROM、RAM、波長啟動(dòng)裝置和點(diǎn)亮鎢燈、點(diǎn)亮氘燈、狹縫裝置和斬波器的自動(dòng)檢測；自帶的UV Solutions程序不僅可以輕松控制儀器精密的機(jī)械系統(tǒng)，而且提供了多元化的信號(hào)與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)切換光源以及波長、掃描速度、狹縫的選擇等多項(xiàng)操作，分析功能強(qiáng)大。U-3900H型分光光度計(jì)在使用上被劃分為4個(gè)功能模塊——波長掃描、時(shí)間掃描、光度測量和核酸測量。使用時(shí)各參數(shù)的設(shè)置很有條理性，對開展生命科學(xué)的研究發(fā)揮了重要的作用。下面就該機(jī)使用時(shí)如何對這4個(gè)功能模塊設(shè)置參數(shù)進(jìn)行解析。

1 U-3900H型紫外可見分光光度計(jì)的光路

U-3900H型紫外可見分光光度計(jì)的光路如圖1所示。他使用的光源由光源WI（鎢燈）和D2（氘燈）所發(fā)出的，光經(jīng)反射聚光鏡M1反射進(jìn)入第一個(gè)單色器集團(tuán)C1。進(jìn)入C1的光經(jīng)濾光器F、狹縫S1，進(jìn)入環(huán)形衍射光柵M2。從M2出來的光通過狹縫S2進(jìn)入第2單色器集團(tuán)C2。進(jìn)入C2的光射入變槳距像差校正衍射光柵M3，從M3出來的光通過狹縫S3，從而完成了將復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任意波長的單色光，不同波長的單色光束連續(xù)依次射出單色器集團(tuán)中的色散元件，從而實(shí)現(xiàn)波長掃描^[4]。由S3出來的單色光經(jīng)平光鏡M4、旋轉(zhuǎn)鏡M5、超環(huán)面反射鏡M6進(jìn)入放對照品的樣品池1。由旋轉(zhuǎn)鏡M5出來的一束光經(jīng)超環(huán)面反射鏡M6、平面鏡M7進(jìn)入放樣品的樣品池2。從樣品池1出來的參考光束經(jīng)超環(huán)面反射鏡M8、平面鏡M9進(jìn)入檢測器PMT（光電倍增管），這時(shí)產(chǎn)生參照測量信號(hào)R。從樣品池2出來的光束經(jīng)超環(huán)面反射鏡M10、平面鏡M11進(jìn)入檢測器PMT，這時(shí)產(chǎn)生樣品測試信號(hào)S。

需要說明的是U-3900H分光光度計(jì)采用Seya-Namioka單色儀，安裝了像差校正凹面光柵。同時(shí)擁有光束的聚焦和色散功能，光學(xué)系統(tǒng)性能強(qiáng)，采用了更少的反射鏡而只需更短的光路，因此消像差能力及光學(xué)明亮度都得到了很大提高。

2 功能模塊解析

2.1 波長掃描模塊

波長掃描模塊的功能是在一定的波長范圍內(nèi)，對樣品進(jìn)行測量，反應(yīng)出樣品在不同波長下的%T（光透過率）、Abs（吸光度值）、E（S）（樣品光束的能量）、E（R）（參照品光束的能量）和%R（光的反射率）。

2.1.1 預(yù)設(shè)程序。檢測樣品之前需打開軟件，在波長掃描的功能模塊預(yù)設(shè)程序，進(jìn)行參數(shù)的選擇與設(shè)置。點(diǎn)擊軟件界面右側(cè)快捷欄的“Method”后，立即顯示分析方法（Analysis Method）的5個(gè)重疊界面，分別為General（常規(guī)）、Instrument（儀器條件）、Monitor（模擬監(jiān)視）、Processing（處理方法）、Report（報(bào)告格式）。

在“Method-General”界面選擇“Wavelength scan”模式。Instrument項(xiàng)會(huì)自動(dòng)給出儀器型號(hào)；填寫所用附件、測試人員、試驗(yàn)內(nèi)容、試驗(yàn)樣品名稱等信息；Load可調(diào)入已經(jīng)存在的條件；Save保存當(dāng)前設(shè)定的信息或Save As將當(dāng)前的信息另存為。參見圖2。

在“Method-Instrument”界面，從%T、Abs、E（S）、E（R）、%R中選擇測量的數(shù)據(jù)模式；設(shè)定波長掃描的范圍（190～1 100 nm）；設(shè)定掃描速度可以有1.5、3.0、15.0、30.0、60.0、120.0、300.0、600.0、1 200.0、1 800.0和2 400.0 nm/min 11種選擇；當(dāng)樣品具有陡峭的光譜數(shù)據(jù)時(shí)，可啟動(dòng)高分辨率模式；設(shè)置基線校正時(shí)，要選擇用戶基線校正，而非系統(tǒng)基線校正；設(shè)置執(zhí)行測樣前需要延緩的時(shí)間，這樣可以讓環(huán)境溫度在測量時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，不會(huì)對測量結(jié)果產(chǎn)生較大的影響；設(shè)置光源是WI還是D2或者是兩者均需要；設(shè)定狹縫寬度可以有0.1、0.5、1.0、2.0、4.0和5.0 nm 6種選擇；設(shè)置PMT模式時(shí)，若常規(guī)測量，選擇自動(dòng)模式，若要測量能量，則需選擇固定模式。當(dāng)選擇了固定模式后，可對PMT的電壓進(jìn)行設(shè)定，設(shè)定范圍為0～1 000 V；對數(shù)據(jù)采集間隔進(jìn)行設(shè)置可以有0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.100 00、0.200 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0、5.00 0 nm 9種選擇；設(shè)定樣品的測量次數(shù)（1～99次）。對光通過測量樣品路徑可以進(jìn)行校正，當(dāng)比色皿不是標(biāo)準(zhǔn)的10 mm時(shí)，通過該設(shè)置可以校正到10 mm的標(biāo)準(zhǔn)測量值（圖3）。

在“Method-Monitor”界面設(shè)置Monitor window的參數(shù)，設(shè)定縱坐標(biāo)的數(shù)值范圍；設(shè)定每次數(shù)據(jù)采集完之后的譜圖是否疊加顯示；設(shè)定數(shù)據(jù)采集完后是否打開數(shù)據(jù)處理窗口；設(shè)定數(shù)據(jù)采集后是否啟動(dòng)自動(dòng)打印（圖4）。

在“Method-Processing”界面設(shè)置數(shù)據(jù)處理方式，數(shù)據(jù)處理方式有Savitsky-Golay Smooth（Savitsky-Golay 平滑）、Mean Smooth（平均平滑）、Median Smooth（中間平滑）、Derivative（微分求導(dǎo)）4種；設(shè)置什么樣的數(shù)據(jù)處理方式是根據(jù)測試者需要檢出的峰（Peak Finding），可以對峰的檢出方法（Integration）、峰的閾值（Threshold）和靈敏度（Sensitivity）進(jìn)行設(shè)置。其中Integration包括Rectangular（矩形）、Trapezoid（斜方形）和Romberg（龍伯格）3種；Threshold可決定信號(hào)峰的取舍，賦值范圍為0.001-1000；Sensitivity可改變放大器的放大倍數(shù)，一般設(shè)置為1（圖3）。

在“Method-Report”界面設(shè)置輸出report的數(shù)據(jù)項(xiàng)，可選擇microsoft excel格式保存輸出、完成后直接打印或利用變換器（需增加儀器附件）打印圖表；打印或保存的項(xiàng)目有data、method、graph、data listing、peak table、peak WL/peak data、start WL/End WL、valley WL/valley data、peak area（圖6）。

2.1.2 基線校正。在平行的參照池和樣品池中均放入空白樣品，點(diǎn)擊“baseline”鍵，進(jìn)行基線校正，等出現(xiàn)綠色ready后，點(diǎn)擊“measure”鍵后，會(huì)出現(xiàn)校正后的基線。

2.1.3 樣品測試。把樣品室池中的空白樣品換成測試樣品，點(diǎn)擊“sample”鍵，在跳出來的sample對話框?qū)悠返拿Q（40個(gè)字符以內(nèi)）、內(nèi)容（255個(gè)字符以內(nèi)）、自動(dòng)保存格式及保存地點(diǎn)進(jìn)行設(shè)置。設(shè)置好之后，點(diǎn)擊“measure”鍵，進(jìn)行樣品的波長掃描測試。

2.2 時(shí)間掃描模塊 時(shí)間掃描模塊的功能是指在一定的波長條件下，一段時(shí)間內(nèi)，測試樣品的Abs、%T、E（S）、E（R）和%R隨時(shí)間變化的情況。

2.2.1 預(yù)設(shè)程序。

檢測樣品之前需打開軟件，在時(shí)間掃描的功能模塊預(yù)設(shè)程序，進(jìn)行參數(shù)的選擇與設(shè)置。點(diǎn)擊軟件界面右側(cè)快捷欄的“Method”后，立即顯示分析方法（Analysis Method）的5個(gè)重疊界面，分別為General（常規(guī)）、Instrument（儀器條件）、Monitor（模擬監(jiān)視）、Processing（處理方法）和Report（報(bào)告格式）。

在軟件的“Method-General”界面選擇“Time scan”模式，該界面的其他參數(shù)選擇與設(shè)置同波長掃描模塊相同。

在軟件的“Method-Instrument”界面，從%T、Abs、E（S）、E（R）、%R中選擇測量的數(shù)據(jù)模式；設(shè)定波長（190～1 100 nm）；設(shè)置測試時(shí)間（60～99 990 s）；選擇在每一次測試樣品之前進(jìn)行自動(dòng)歸零。此外，其他參數(shù)的設(shè)置和選擇與波長掃描模塊相同。

在“Method-Monitor”界面設(shè)置Monitor window的參數(shù)，設(shè)定橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)的數(shù)值范圍（橫坐標(biāo)為時(shí)間t）；設(shè)定每次數(shù)據(jù)采集后的譜圖是否疊加顯示；設(shè)定數(shù)據(jù)采集后是否打開數(shù)據(jù)處理窗口；設(shè)定數(shù)據(jù)采集后是否自動(dòng)打印。

在“Method-Processing”界面設(shè)置數(shù)據(jù)處理方式、檢出峰的參數(shù)，均與波長掃描模塊相同。與波長掃描不同的是可對動(dòng)力學(xué)研究中的起始、終止時(shí)間以及動(dòng)力學(xué)因子進(jìn)行設(shè)置。

在“Method-Report”界面設(shè)置輸出report的數(shù)據(jù)項(xiàng)，數(shù)據(jù)輸出項(xiàng)的設(shè)置與波長掃描模式中的基本相同，只是多了一項(xiàng)kinetics。

2.2.2 樣品測試。放入待測樣品和參比液，點(diǎn)擊“sample”鍵，在跳出來的sample對話框中對樣品的名稱、內(nèi)容、自動(dòng)保存格式及保存地點(diǎn)進(jìn)行設(shè)置。設(shè)置好之后，點(diǎn)擊“autozero”鍵，進(jìn)行樣品測試前的自動(dòng)歸零。點(diǎn)擊“measure”鍵，進(jìn)行樣品的時(shí)間掃描測試。

2.3 光度測量模塊

光度測量模塊的功能是通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知樣品的濃度。

2.3.1 預(yù)設(shè)程序。 操作之前需要打開軟件，選擇或設(shè)置相關(guān)參數(shù)。點(diǎn)擊軟件界面右側(cè)快捷欄的“Method”后，立即顯示分析方法（Analysis Method）的7個(gè)重疊界面，分別為General（常規(guī)）、Quantitation（定量分析）、Instrument（儀器條件）、Standards（標(biāo)準(zhǔn)品）、Monitor（模擬監(jiān)視）、Processing（處理方法）、Report（報(bào)告格式）。

在軟件的“Method-General”界面選擇“Photometry”模式，該界面的其他參數(shù)選擇與設(shè)置同波長掃描模塊相同。

在軟件的“Method-Quantitation”中，測量類型可從波長、峰面積、峰高、微分求導(dǎo)和比例中選擇。如果選擇了波長，只有設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)曲線的類型、波長數(shù)目、濃度單位和濃度的有效數(shù)字（10n，設(shè)置n的值），才能相應(yīng)獲取一級(jí)校準(zhǔn)曲線、2級(jí)校準(zhǔn)曲線、3級(jí)校準(zhǔn)曲線和SEGMENT校準(zhǔn)曲線等4種類型的校準(zhǔn)曲線和樣品的相關(guān)數(shù)據(jù)。如果選擇了峰面積、峰高，并設(shè)定了指定波長，峰的檢出方法從rectangular、trapezoid和romberg中進(jìn)行選擇，設(shè)置濃度單位和濃度的有效數(shù)字，才能獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的濃度。如果選擇了微分求導(dǎo)為測量類型，需要設(shè)置波長、標(biāo)準(zhǔn)曲線的類型、濃度單位、濃度的有效數(shù)字以及微分求導(dǎo)方法，才能獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度。如果選擇了比例為測量類型，需要設(shè)置K-factor0、K-factor1、K-factor2因子以及計(jì)算方法（減法、加法或乘法），然而此種測量類型將不能獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在“Method-Instrument”界面，如果選擇了波長和比例為測量類型，那么需要設(shè)置波長、光源、狹縫寬度、PMT模式和范圍，以及校正光通過測量樣品路徑。這些參數(shù)的設(shè)定與波長掃描模塊相同。如果選擇了峰面積、峰高、微分求導(dǎo)為測量類型，那么僅設(shè)定Abs為數(shù)據(jù)模式，需要設(shè)置波長范圍、掃描速度、分辨率模式、基線校正、光源、狹縫寬度、PMT模式和范圍、樣品的測量次數(shù)，以及校正光通過測量樣品路徑等，這些參數(shù)的設(shè)定與波長掃描模塊相同。

在“Method-Standars”界面，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品的序號(hào)、名稱、內(nèi)容、濃度等。

在“Method-Monitor”界面設(shè)置Monitor window的參數(shù)，方式及意義同波長掃描模塊。

在“method-report”對話框中選擇輸出report的數(shù)據(jù)項(xiàng)，參數(shù)設(shè)置與波長掃描模塊類似。

2.3.2 自動(dòng)歸零或基線校正。

如果選擇波長或比例為測量類型，那么在“Method-Instrument”界面選擇在每次側(cè)樣之前進(jìn)行自動(dòng)歸零；如果選擇了峰高、峰面積或微分求導(dǎo)為測量類型，那么在測樣之前需要執(zhí)行基線校正。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的測量。

放入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和參比液，點(diǎn)擊“sample”鍵，在跳出來的sample對話框中對標(biāo)準(zhǔn)品/樣品的名稱、內(nèi)容、自動(dòng)保存格式及保存地點(diǎn)進(jìn)行設(shè)置。設(shè)置好之后，點(diǎn)擊“measure”鍵，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的測量；按照“Method-Standars”中設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)品順序，依次測量標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品測量完成后，會(huì)跳出一個(gè)對話框，選擇開始測量未知樣品，進(jìn)行未知樣品的測量。

2.4 核酸測量模塊 核酸測量模塊的功能是通過測量特定波長處的吸光度值來計(jì)算各種核酸（RNA、ssDNA、dsDNA、labeled DNA）樣品的純度、比例、濃度、摩爾濃度及蛋白質(zhì)濃度等。

2.4.1 預(yù)設(shè)程序。

操作之前需要打開軟件，選擇或設(shè)置相關(guān)參數(shù)。點(diǎn)擊軟件界面右側(cè)快捷欄的“Method”后，立即顯示分析方法（Analysis Method）的7個(gè)重疊界面，分別為General（常規(guī)）、Instrument（儀器條件）、Monitor（模擬監(jiān)視）、Processing（處理方法）、Nuleic acid parameter（核酸參數(shù)）、Base sequence parameter（堿基序列參數(shù)）、 Report（報(bào)告格式）。

在軟件的“Method-General”界面選擇“Nucleic Acid Measurement”模式，該界面的其他參數(shù)選擇和設(shè)置與波長掃描模塊相同。

在軟件的“Method-Instrument”界面，測量的數(shù)據(jù)模式通常只選擇Abs；如果未專門做背景校正，那么波長的范圍設(shè)定在230 nm<λ<280 nm，如果選擇了320 nm<λ<350 nm范圍內(nèi)的任意波長λ₁處的Abs做了背景校正，那么波長的范圍設(shè)定在230nm<λ<λ₁。該界面的其他參數(shù)設(shè)置與波長掃描模式中的相同。

在“Method-Monitor”界面設(shè)置Monitor window的參數(shù)，與波長掃描模塊相同。

在“Method-Processing”界面設(shè)置數(shù)據(jù)處理方式，與波長掃描模塊相同。

在“Method-Nuleic acid parameter”界面，測量數(shù)據(jù)的模式選擇了RNA、ssDNA、dsDNA中的一個(gè)；選擇并設(shè)置背景校正參數(shù)；設(shè)置濃度計(jì)算時(shí)的濃度因子、濃度單位、濃度的有效數(shù)字；在測量核酸樣品的純度、比例、濃度、摩爾濃度及蛋白質(zhì)濃度等時(shí)，需要設(shè)置兩個(gè)測量波長（260和280 nm）；若結(jié)果中顯示測量比例的結(jié)果，那么選擇測量比例項(xiàng)，還可對純度的上下限進(jìn)行設(shè)置，或指定純度值；設(shè)定系數(shù)K₀、K₁、K₂通過Warburg-Christian方法自動(dòng)計(jì)算出蛋白質(zhì)的濃度。若選擇了labeled DNA作為測量數(shù)據(jù)的模式，那么在測量波長處需要設(shè)定消光系數(shù)e₁，在色素標(biāo)記波長處需要設(shè)定DNA的消光系數(shù)e₂，在測量波長處設(shè)定色素的消光系數(shù)e₃，輸入色素標(biāo)記物的波長、測量波長，設(shè)置濃度單位和濃度的有效數(shù)字。

在“Method-Base sequence parameter”界面，輸入A、C、G和T各種堿基的數(shù)目，輸入、上傳或粘貼堿基序列（不超過1 056 bp）。

在“Method-Report”界面設(shè)置輸出report的數(shù)據(jù)項(xiàng)，參數(shù)設(shè)置與波長掃描模塊相同。

2.4.2 基線校正。參數(shù)設(shè)置和操作與波長掃描相同。

2.4.3 樣品測量。參數(shù)設(shè)置和操作也與波長掃描相同。

3 結(jié)語

紫外可見分光光度計(jì)不僅使用歷史悠久，而且在多個(gè)研究與應(yīng)用領(lǐng)域具有不可替代的作用。隨著現(xiàn)代科技與生產(chǎn)的不斷發(fā)展與進(jìn)步，紫外可見分光光度計(jì)的性能指標(biāo)不斷被提高，其功能在使用上也越來越便捷。U-3900H型紫外可見分光光度計(jì)就是一款不僅性能指標(biāo)優(yōu)良，而且具有非常清晰明確的4個(gè)功能模塊，在使用上非常方便。為了發(fā)揮該款儀器的使用效率，應(yīng)該首先掌握其4個(gè)功能模塊的參數(shù)設(shè)置。

參考文獻(xiàn)

[1]倪一，黃梅珍，袁波，等.紫外可見分光光度計(jì)的發(fā)展與現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2004（3）：3-11.

[2] 李昌厚. 紫外可見風(fēng)光光度計(jì)書[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[3] 朱英，和惠朋，武曉博，等. 紫外可見分光光度計(jì)及其應(yīng)用[J].華工中間體，2012（11）：34-37.

[4] 潘鈴，郭宏，朱昊，等. U-3400分光光度計(jì)在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中的常見問題與解決方法[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2005，22（3）：34-36.