李楠 周瑞芳 鄧智年 辛明 張娥珍

摘要

[目的]優(yōu)化利用甘蔗尾葉復(fù)合甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液生產(chǎn)腐植酸工藝。[方法]以甘蔗尾葉和甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液為原料，通過白腐真菌、巨大芽孢桿菌、綠色木酶3種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)腐植酸，利用單因素試驗及正交試驗確定了此3種微生物混合發(fā)酵的最佳工藝條件。[結(jié)果]試驗得出3種微生物混合發(fā)酵的最佳工藝條件：最適培養(yǎng)時間6 d，最佳甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液錘度為18°Bx、初始pH為6.0，溫度31 ℃，最優(yōu)液料比為3∶1 ml/g，白腐真菌、巨大芽孢桿菌、綠色木酶3種菌最佳比例1∶1∶2，總接種量12%。其中發(fā)酵時間對腐植酸含量有顯著性影響，在最優(yōu)條件下的腐植酸含量為15.61%，較優(yōu)化前提高了45.48%。[結(jié)論]研究充分利用了甘蔗尾葉及甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)，獲得了生物活性高的生化腐植酸產(chǎn)品，其環(huán)境效益、經(jīng)濟效益及社會效益顯著，具有廣闊的的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞 甘蔗尾葉；甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液；混合發(fā)酵；腐植酸；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號 S566.1 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）26-09153-04

Study on Producing Humic Acid with Sugarcane Caudate Lobe and Sugarcane Molasses Alcohol Fermentation Broth

LI Nan， ZHANG E-zhen et al

（College of Life Science and Technology， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004； Institute of Agro-products Processing， Guangxi Academy of Agricultural sciences， Nanning， Guangxi 530007）

Abstract [Objective] To study on producing humic acid with sugarcane caudate lobe and sugarcane molasses alcohol fermentation broth. [Method] With sugarcane caudate lobe and sugarcane molasses alcohol fermentation broth as raw material， humic acid was produced by mixed fermentation of white-rot fungi， Bacillus megaterium and Trichoderma reesei. Using single-factor test and orthogonal test， the optimal technique conditions were determined. [Result] The optimal conditions are： time 6 d， 31 ℃， 18 °Bx and pH 6.0 of sugarcane molasses alcohol fermentation broth， liquid-material ratio 3， the proportion of inoculation was 1∶1∶2， total inoculum size 12%， and the fermentation time had a significant effect on the content of humic acid. In the above optimal conditions， HA content reached 15.61%， and increased by 45.48% than before optimization. [Conclusion] The nutrient materials in sugarcane caudate lobe and sugarcane molasses alcohol fermentation broth were utilized to obtain biochemical humic acid product with high biological activity， which has significant environment， economic and social benefits， as well as broad development prospect.

Key words Sugarcane caudate lobe； Sugarcane molasses alcohol fermentation broth； Mixed fermentation； Humic acid； Optimization of the fermentation conditions

目前甘蔗種植面積最大的國家是巴西，其次是印度，我國位居第三，而廣西占全國甘蔗種植面積的63%^[1]。甘蔗收割季節(jié)，甘蔗尾葉除部分作為牛羊青料喂養(yǎng)外，大部分被蔗農(nóng)焚燒在蔗地，由此會造成環(huán)境污染和肥力流失。甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液是制糖工業(yè)中的殘留物——甘蔗糖蜜進行酒精發(fā)酵后產(chǎn)生的醬酒色、高濃度酸性的有機廢水^[2]，是制糖工業(yè)最為嚴重的污染源^[3]。它排放量大、顏色深、酸度大、營養(yǎng)豐富、成分復(fù)雜，若不加利用而直接排入水體中，不僅浪費了資源，而且對環(huán)境污染十分嚴重^[4]。

腐植酸（Humic Acid，簡稱HA）是由死亡的動植物遺骸在水分和空氣存在的條件下經(jīng)長期微生物分解、轉(zhuǎn)化及地球物理化學(xué)作用后生成的復(fù)雜無定形高分子化合物^[5]。它含有羧基、羥基、醇羥基、醌基、羰基、甲氧基等多種活性基團，具有弱酸性、親水性、絡(luò)合性、膠體吸附性、螯合性等特性^[6]，其應(yīng)用已經(jīng)滲透到工、農(nóng)、醫(yī)等各個領(lǐng)域。腐植酸一般從泥炭、風(fēng)化煤中提取得到，近年來發(fā)酵法生產(chǎn)腐植酸產(chǎn)品是研究開發(fā)的熱點。發(fā)酵法生產(chǎn)腐植酸是模擬天然腐植酸的生成過程，將特定的微生物接種到培養(yǎng)基中，通過微生物發(fā)酵而制取腐植酸的過程^[7]，其腐植酸產(chǎn)品與普通礦源腐植酸相比，具有更高比例的官能團、分子量小、生物活性高、水溶性好、抗硬水能力強等優(yōu)點，與此同時，還含有多種有益微生物種群^[8]。

筆者以農(nóng)業(yè)廢棄物甘蔗尾葉及甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液為原料，通過微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)腐植酸作為有機肥，既充分利用了甘蔗尾葉及甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)，減輕了對環(huán)境的污染，又獲得了生物活性高的生化腐植酸產(chǎn)品，其環(huán)境效益、經(jīng)濟效益及社會效益顯著，具有廣闊的發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

菌株來源。白腐真菌、巨大芽孢桿菌、綠色木霉，廣西大學(xué)食品發(fā)酵研究所保藏。

1.1.2

發(fā)酵原料來源。甘蔗尾葉：廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院武鳴實驗基地實驗田種植的甘蔗。甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液：廣西南寧糖業(yè)股份有限公司。

1.1.3

培養(yǎng)基。

1.1.3.1

斜面培養(yǎng)基。綜合馬鈴薯培養(yǎng)基：20%馬鈴薯汁1 L，葡萄糖20.0 g，KH₂PO₄3.0 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，硫胺素8.0 mg，瓊脂20.0 g，pH 6.5。營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.0～7.2。

1.1.3.2

搖瓶培養(yǎng)基。綜合馬鈴薯液體培養(yǎng)基：20%馬鈴薯汁1 L，葡萄糖20.0 g，KH₂PO₄3.0 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，硫胺素8.0 mg， pH 6.5。營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.0～7.2。

1.1.3.3

發(fā)酵培養(yǎng)基。甘蔗尾葉干燥粉碎后過20目篩，取6.0 g置于250 ml三角瓶內(nèi)，以4∶1 ml/g的液料比添加錘度12°Bx、pH 6.0的甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液，混合均勻后121 ℃滅菌20 min。

1.1.4

主要儀器。XT-200型高速多功能粉碎機，浙江永康紅太陽機電有限公司；METTLER TOLEDO 320 pH計；METTLER TOLEDO PL303 精密電子天平，德國METTLER公司；SPX-250恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；SKY-211B振蕩培養(yǎng)箱，上海蘇坤公司等儀器。

1.2 方法

1.2.1

初始發(fā)酵培養(yǎng)及后續(xù)發(fā)酵條件優(yōu)化。以12°Bx、pH 6.0的甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基原料之一。初始發(fā)酵情況簡述：甘蔗尾葉干燥粉碎后過20目篩，取6.0 g置于250 ml三角瓶內(nèi)，以4∶1 ml/g的液料比添加錘度12°Bx、pH 6.0的甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液，白腐真菌、巨大芽孢桿菌、綠色木酶3種菌初始接種比例選取1∶1∶1、總接種量為10%，28 ℃下培養(yǎng)。依次考察發(fā)酵時間、糖蜜酒精發(fā)酵液濃度及初始pH、發(fā)酵培養(yǎng)基液料比、發(fā)酵溫度、3種菌接種比例及總接種量對腐植酸產(chǎn)量的影響。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計正交試驗，探索較佳的發(fā)酵工藝參數(shù)。

1.2.2

腐植酸含量的測定方法。

目前，腐植酸含量的測定方法主要有容量法和重量法^[9]。容量法理論上是測定樣品中的HA所含的碳^[10]，由于該試驗發(fā)酵原料甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液中含有大量的殘?zhí)?、色素，這些物質(zhì)都將在測定過程中對實際結(jié)果產(chǎn)生干擾，因此，該試驗中腐植酸含量的測定方法不宜選用容量法。而重量法是以腐植酸不溶于酸但可溶于堿為依據(jù)進行提取測定，過程中不存在容量法的缺點，實際測定值較準(zhǔn)確，因而該研究采用重量法來進行腐植酸含量的測定。參照黃金鳳等的腐植酸提取的操作流程^[11]，用1% NaOH溶液來提取發(fā)酵樣品中的腐植酸，然后用重量法測定腐植酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)品中腐植酸含量的影響

為確定后續(xù)試驗的發(fā)酵周期，分別發(fā)酵2、4、6、8、10 d后進行腐植酸含量測定。圖1顯示了腐植酸含量在發(fā)酵過程中隨時間的變化情況。發(fā)酵初期，腐植酸含量增長較快，是由于培養(yǎng)基中大量的營養(yǎng)物質(zhì)被利用進而轉(zhuǎn)化為有機酸類物質(zhì)；當(dāng)發(fā)酵時間為6 d時，腐植酸含量達到最大值10.73%，培養(yǎng)時間超過6 d后，腐植酸產(chǎn)量逐漸有所下降。因此，發(fā)酵時間選擇6 d較佳。

2.2 甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液錘度對發(fā)酵產(chǎn)品中腐植酸含量的影響

甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液成分復(fù)雜，含有大量的有機物，其中碳源、氮源和無機鹽離子種類豐富，能夠提供微生物生長代謝所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。由于微生物在其生長代謝過程中不僅需要合適的碳源、氮源、無機鹽離子種類，同時還需要合適的碳源、氮源及無機鹽離子濃度。將甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液稀釋成不同錘度后配制培養(yǎng)基，不僅可以改變培養(yǎng)基中碳源、氮源、無機鹽離子等營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，而且也改變了培養(yǎng)基的黏稠度和通氣性，進而對微生物的生長和產(chǎn)物的合成產(chǎn)生一定的影響。為確定培養(yǎng)基中甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液的適宜濃度，將調(diào)至10、12、14、16、18、20、22°Bx的甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液分別配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵6 d后，測定腐植酸的含量。如圖2所示，在甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液的錘度為18 °Bx時，發(fā)酵產(chǎn)品中腐植酸的含量最大。因此，甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液的錘度選擇18°Bx較好。

2.3 甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液初始pH對發(fā)酵產(chǎn)品中腐植酸含量的影響

由于氫離子與細胞膜上的酶相互作用，發(fā)酵培養(yǎng)基中的pH將對微生物細胞膜通透性、各種酶的活性、底物結(jié)合等方面產(chǎn)生影響，因此合適的pH環(huán)境必將有利于微生物的生長代謝。為確定該試驗中微生物所需的較佳pH環(huán)境，將初始pH調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液分別配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵6 d后，測定腐植酸的含量。如圖3所示，當(dāng)初始pH為6.0時，腐植酸含量最高，所以甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液初始pH選取6.0較適宜。

2.4 液料比對發(fā)酵產(chǎn)品中腐植酸含量的影響

由于甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液中含有碳源、氮源、無機鹽離子等微生物生長代謝所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，因而液料配比將對發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機鹽離子等營養(yǎng)物質(zhì)含量產(chǎn)生直接影響。同時，液料配比也會對培養(yǎng)基的物理狀態(tài)產(chǎn)生影響，液體比例越小，基質(zhì)越干燥，空隙較多，通氣性越好；反之則越接近流體，在靜置培養(yǎng)的條件下，通氣性較差。為確定培養(yǎng)基中較為合適的液料比，將初始發(fā)酵培養(yǎng)基的液料比分別調(diào)至2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1、4.0∶1、4.5∶1、5.0∶1 ml/g，發(fā)酵6 d后，測定腐植酸的含量。如圖4所示，當(dāng)初始發(fā)酵培養(yǎng)基液料比為3.0∶1 ml/g時，腐植酸含量最高，故初始發(fā)酵培養(yǎng)基液料比選擇3.0∶1 ml/g較好。

2.5 發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)品中腐植酸含量的影響

由于微生物的生長及其代謝產(chǎn)物的合成都是在各種酶的催化作用下進行的，培養(yǎng)溫度對酶活力大小產(chǎn)生直接影響，進而影響到微生物的生長及其代謝，所以適宜的培養(yǎng)溫度于微生物而言十分重要。為確定較佳的發(fā)酵溫度，分別在22、25、28、31、34 ℃溫度下進行試驗，發(fā)酵后分別測定發(fā)酵產(chǎn)品中腐植酸含量。試驗結(jié)果如圖5所示，隨著培養(yǎng)溫度升高，腐植酸的含量也隨著增加，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過28 ℃時，溫度越高，腐植酸含量反而降低。因此，培養(yǎng)溫度選擇28 ℃較為合適。

2.6 菌種比例對發(fā)酵產(chǎn)品中腐植酸含量的影響

該研究是以甘蔗尾葉和甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液為原料，通過白腐真菌、巨大芽孢桿菌、綠色木酶3種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)腐植酸。由于3種菌作用各不相同，因而選取適宜的接種比例不僅有利于對培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，而且有利于所需代謝產(chǎn)物的生成。在總接種量一定的條件下，將白腐真菌、巨大芽孢桿菌、綠色木酶3種微生物按不同的比例接種。試驗結(jié)果如圖6所示，在白腐真菌、巨大芽孢桿菌、綠色木酶3種菌比例為1∶1∶2時，腐植酸含量最大。因此，3種菌比例選擇1∶1∶2較佳。

2.8 發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果

通過上述單因素試驗，初步確定了以甘蔗尾葉和甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液為原料，通過白腐真菌、巨大芽孢桿菌、綠色木酶3種微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)腐植酸的最優(yōu)條件。為了進一步確定各因素的最優(yōu)組合，以單因素試驗為依據(jù)，對發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、液料比3個因素進行正交試驗，其他條件均保持單因素優(yōu)化確定的最優(yōu)條件。正交試驗因素水平設(shè)計見表1。

根據(jù)正交試驗結(jié)果（表2）和方差分析（FA=36.757>F0.05=19.000；FB=8.781C>B，即發(fā)酵時間>液料比>發(fā)酵溫度，3個因素最佳條件組合為A₂C₂B₃。即3種菌接種到液料配比為3.0∶1 ml/g的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在31 ℃培養(yǎng)6 d的條件下，腐植酸含量最高。在該條件下的驗證性試驗結(jié)果表明，在此組合的條件下，腐植酸含量最高為15.61%，較優(yōu)化前提高了45.48%。因此該試驗選擇此3個因素的最佳組合為發(fā)酵時間6 d、發(fā)酵溫度31 ℃、液料比3.0∶1 ml/g。

3 結(jié)論

通過單因素試驗及正交試驗確定了此3種微生物混合發(fā)酵的最佳工藝條件：最適培養(yǎng)時間6 d，最佳甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液錘度為18°Bx、初始pH為6.0，溫度31 ℃，最優(yōu)液料比為3.0∶1 ml/g，白腐真菌、巨大芽孢桿菌、綠色木酶3種菌最佳比例1∶1∶2，總接種量12%。其中發(fā)酵時間對腐植酸含量有顯著性影響。在最優(yōu)條件下的腐植酸含量為15.61%，較優(yōu)化前提高了45.48%。

該試驗以甘蔗尾葉及甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液為原料，通過微生物混合發(fā)酵生產(chǎn)具有廣泛用途的腐植酸，不僅促進了甘蔗尾葉及甘蔗糖蜜酒精發(fā)酵液廢棄資源的循環(huán)再利用，而且亦為農(nóng)業(yè)有機廢棄物資源化、功能化及綜合利用提供了參考，實現(xiàn)了由過去的“資源—產(chǎn)品—廢棄物”的物質(zhì)單向流動向“資源—產(chǎn)品—廢棄物—再生資源”循環(huán)式經(jīng)濟模式的轉(zhuǎn)變，生態(tài)環(huán)境效益和經(jīng)濟效益顯著，具有廣闊的發(fā)展前景。

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