婁婧婧 陳偉民 趙廣才

摘要[目的]在昆蟲S2細(xì)胞中重組表達(dá)斑馬魚IL10蛋白。[方法]PCR擴(kuò)增斑馬魚IL10蛋白編碼基因，連接到分泌表達(dá)載體pMT/Bip/V5-His A中與輔助質(zhì)粒pCoBlast共轉(zhuǎn)染S2昆蟲胚胎細(xì)胞，通過Blasticidin加壓篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)斑馬魚IL10的細(xì)胞系。用硫酸銅誘導(dǎo)IL10蛋白表達(dá)，收集無血清的細(xì)胞表達(dá)上清，采用SDSPAGE及Western鑒定目的蛋白。[結(jié)果]目的蛋白在昆蟲細(xì)胞中獲得表達(dá)，SDSPAGE結(jié)果表明相對分子質(zhì)量為23 kD，與預(yù)期結(jié)果相一致。[結(jié)論]獲得了重組斑馬魚IL10蛋白，為進(jìn)一步在蛋白水平上研究其功能和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞斑馬魚；IL10蛋白；S2細(xì)胞；真核表達(dá)

中圖分類號S965.119文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07769-04

作者簡介婁婧婧（1986- ），女，湖南長沙人，研究實習(xí)員，碩士，從事食品安全生物學(xué)研究。

收稿日期20140710細(xì)胞因子由造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)或炎癥反應(yīng)中的活化細(xì)胞產(chǎn)生，能調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮功能，是高活性功能的多肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白。細(xì)胞因子及其構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)在免疫調(diào)節(jié)方面起著重要。白細(xì)胞介素10（IL10）是一種細(xì)胞因子，主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，是能抑制Th1細(xì)胞釋放細(xì)胞因子（IFNγ和IL2等）的免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子[1]。研究表明，IL10能抑制炎癥介質(zhì)因子的分泌，是非常有效的抗炎介質(zhì)，在體液免疫中起重要作用[2]。動物和人體的各種體內(nèi)研究表明，IL10治療可以降低炎癥的嚴(yán)重程度[3]。

在人類和魚類的基因組中，IL10基因的大小大約為2 kb。第1個外顯子編碼信號肽和A螺旋結(jié)構(gòu)。第2個外顯子編碼AB魯普結(jié)構(gòu)和B螺旋結(jié)構(gòu)。第3個外顯子編碼C和D螺旋結(jié)構(gòu)。第4個外顯子編碼DE魯普結(jié)構(gòu)和E螺旋結(jié)構(gòu)。第5個外顯子編碼F螺旋和羧基端的尾巴以及1個不翻譯的包括AUUUA的片段，當(dāng)這個片段與AUF1結(jié)合時，會降低IL10mRNA的穩(wěn)定性[4]。

鱖魚傳染性脾腎壞死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus， ISKNV）是近年來廣東鱖魚養(yǎng)殖業(yè)爆發(fā)性流行病的主要病因之一，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。ISKNV以鱖魚脾和腎為主要侵入組織，引起脾腎細(xì)胞的腫大和壞死。近年來，越來越多的學(xué)者通過研究ISKNV病毒作用機(jī)制來探討魚類天然免疫機(jī)制。國內(nèi)研究表明，ISKNV感染斑馬魚后斑馬魚體內(nèi)的IL10含量迅速升高[5]。據(jù)此推測，IL10參與了魚類的免疫調(diào)節(jié)，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。為此，筆者構(gòu)建了斑馬魚IL10基因真核表達(dá)載體，融合表達(dá)并純化了IL10蛋白，以期為進(jìn)一步的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞由實驗室保存；真核表達(dá)載體pMT/Bip/V5-His A購自英俊公司，PCR膠回收、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；DNA Marker、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XhoⅠ及T4 DNA 連接酶、高保真DNA聚合酶均購自TaKaRa 公司；Schneiders Drosophila Medium和FBS、Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑均購自Invitrogen公司；antiV5 antibody購自Sigma公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自大連寶生物公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，購自威佳公司。

1.2斑馬魚IL10基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建從斑馬魚脾臟組織中提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA為模板，結(jié)合真核表達(dá)載體pMT/Bip/V5-His A的多克隆位點(diǎn)和IL10基因的限制性酶切位點(diǎn)，根據(jù)NCBI網(wǎng)站上斑馬魚IL10基因的編碼序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴(kuò)增引物。在上下游引物的5端分別加上KpnⅠ和XholⅠ的酶切位點(diǎn)，引物序列為：DIL10PF： 5 GGGGTACCcAGGAGAGTCGAATGCAAAAC 3；DIL10PR： 5 CCGCTCGAGGTGCTTAACCCTCTTTGAG 3。

PCR反應(yīng)體系包括0.5 μmol/L 正向/反向引物、2 ng cDNA 模板、dNTP 混合液各2.5 mmol/L、緩沖液（添加Mg2+）、Kodplus DNA 聚合酶0.025 U，用滅菌三蒸水補(bǔ)齊至50 μl。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s 30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用試劑盒回收目的片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。分別用XhoⅠ和KpnI雙酶切純化產(chǎn)物和真核表達(dá)載pMT/Bip/V5-His A，回收雙酶切片段，T4 DNA 連接酶16 ℃連接過夜，構(gòu)建pMT/Bip/V5-His A-IL10的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在氨芐青霉素抗性平板上挑取單克隆37 ℃振蕩培養(yǎng)，菌液PCR篩選陽性克隆后測序[6]。引物合成和測序均由上海英俊生物工程有限公司完成。

1.3IL10蛋白的真核表達(dá)及穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選用試劑盒提取測序驗證無誤的目的重組菌的無內(nèi)毒素質(zhì)粒待用。取無血清SDM培養(yǎng)基培養(yǎng)的S2單層細(xì)胞轉(zhuǎn)板后培養(yǎng)待其貼壁生長并達(dá)到一定密度后，將無內(nèi)毒素質(zhì)粒及Cellfectin轉(zhuǎn)染細(xì)胞，28 ℃下培養(yǎng)18 h，棄去舊培養(yǎng)液，加入含10%FBS的培養(yǎng)基（添加雙抗）繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)約3～5 d，待其生長到分裂期，將原培養(yǎng)基換成添加抗生素（Blasticidin）的10%FBS的SDM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。篩選細(xì)胞過程中約4～5 d換液1次，篩選14 d后開始擴(kuò)大培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后篩選細(xì)胞前和篩選細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)后，分別用硫酸銅誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。在培養(yǎng)基中加入500 μg/ml的硫酸銅，將細(xì)胞置于28 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4IL10蛋白的純化取篩選后誘導(dǎo)的細(xì)胞，在誘導(dǎo)后第4天開始收集細(xì)胞上清，將上述濾液過Ni2+金屬螯合層析柱，用Novagen公司的His.Bind 純化試劑盒，通過鎳螯合層析純化His-Tag 融合蛋白。用含不同濃度咪唑（60和120 mmol/L）的洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，6 mol/L尿素，pH8.0）梯度洗脫后，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白檢測。

1.5IL10蛋白的檢測及Western blotting分析按照常規(guī)方法處理樣品進(jìn)行SDSPAGE，檢測蛋白的表達(dá)情況。Western blot分析，將SDS-PAGE凝膠上的條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用50 g/L脫脂乳封閉，用antiV5 抗體作為一抗，以1∶5 000倍稀釋的羊抗兔IgG（堿性磷酸酶標(biāo)記）作為二抗，經(jīng)NBT/BCIP顯色，觀察特異性條帶[7]。

2結(jié)果與分析

2.1IL10基因的PCR擴(kuò)增以提取斑馬魚脾臟組織RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，利用設(shè)計的上游引物PF和下游引物PR進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳可見清晰的目的片斷擴(kuò)增條帶，條帶大小為474 bp與設(shè)計長度相符，且未出現(xiàn)其余雜帶，擴(kuò)增的特異性良好。

2.2 pMT/Bip/V5His AIL10的真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定從可以看出，酶切后產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳可見2條清晰條帶，1條為pMT/Bip/V5His A載體條帶3.6 kb，另1條為IL10基因目的片段（474 kb），證明pMT/Bip/V5His AIL10真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，測序驗證目的片段序列也與IL10的序列相符。

注：M.DL1000 Marker；1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

IL10基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果注：M.DL1000 Marker；1.陽性克隆的產(chǎn)物。

重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定2.3篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系培養(yǎng)S2細(xì)胞待其生長良好貼壁達(dá)到一定密度后拍照，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后與篩選初期和后期分別拍照。發(fā)出熒光的細(xì)胞均為成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。從中可以看出，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高；加壓篩選后，熒光細(xì)胞的密度顯著增大。

注：A.正常生長的S2細(xì)胞；B.轉(zhuǎn)染后未經(jīng)篩選的S2細(xì)胞；C.加壓篩選后的細(xì)胞。

S2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選結(jié)果2.4細(xì)胞表達(dá)上清的SDSPAGE及 Western blot鑒定從可以看出，純化前細(xì)胞上清的電泳條帶中可見目的條帶和雜帶；純化后23 kD處出現(xiàn)清晰的條帶，大小與重組IL10蛋白相符；經(jīng)Western blot后，在纖維素膜的預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，進(jìn)一步驗證了細(xì)胞表達(dá)的正確性。

3討論

3.1斑馬魚IL10基因的序列分析幾種脊椎動物的IL10基因已經(jīng)被克隆出來，比如人、老鼠、鳥類和魚類。結(jié)果表明，魚類IL10的表達(dá)模式與哺乳動物不同，魚類中不同種類的魚的表達(dá)模式也不同。斑馬魚的IL10氨基酸序列與其他已知的IL10氨基酸序列相似度為29.7%～80.9%，斑馬魚和普通草魚的相似度最高，達(dá)到80.9%[2]。國外的研究表明，IL10基因在同一家族的魚中是高度保守的。

3.2斑馬魚IL10基因的真核表達(dá)果蠅胚胎細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（Drosophila Schneider 2 cell expression system）是一個高效表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)，該系統(tǒng)因表達(dá)質(zhì)粒的不同分為組成性表達(dá)和分泌型表達(dá)，穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的的篩選過程是在篩選壓力下將外源基因整合到果蠅基因組中的過程。分泌蛋白注：M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ；1.純化前；2.純化后；3.Western blot結(jié)果。

細(xì)胞上清的SDSPAGE及Western鑒定42卷23期婁婧婧等重組斑馬魚IL10蛋白的真核表達(dá)幾種已知IL10氨基酸序列的比較的表達(dá)是在金屬硫蛋白（MT）的控制下的，在鋅、銅、錳、鐵、鉬等金屬離子的誘導(dǎo)下，該系統(tǒng)可啟動高效的外源蛋白表達(dá)[8-10]。

果蠅S2表達(dá)系統(tǒng)具有許多其他表達(dá)系統(tǒng)所無法比擬的優(yōu)越性。首先，許多種類的載體都可以在S2細(xì)胞中表達(dá)目的重組蛋白，選擇pMT/Bip/V5His A載體是因為IL10是分泌到細(xì)胞外的蛋白，而pMT/Bip/V5His載體包括果蠅細(xì)胞分泌信號，可誘導(dǎo)表達(dá)分泌目的蛋白[11]。其次，此系統(tǒng)為真核表達(dá)系統(tǒng)，可以對目的蛋白進(jìn)行真核表達(dá)系統(tǒng)的修飾。由于該試驗的研究對象是斑馬魚，使用真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)IL10就比使用原核表達(dá)系統(tǒng)更好，更適用于斑馬魚的研究。再次，此表達(dá)系統(tǒng)能在半個月獲得穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞系，比起其他真核表達(dá)系統(tǒng)耗時較短。國內(nèi)已有人已經(jīng)成功運(yùn)用這個表達(dá)系統(tǒng)獲得了干擾素有活性的蛋白，且表達(dá)的蛋白量大約為1 ml上清中有2 μg目的蛋白[12]，因此通過這一表達(dá)系統(tǒng)便于獲取有活性的斑馬魚IL10蛋白，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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