孫素玲 徐園芳

摘要[目的]為動(dòng)物組織中氟苯尼考?xì)埩艨焖贆z測(cè)試紙條的制備奠定基礎(chǔ)。[方法]采用琥珀酸酐法制備氟苯尼考人工半抗原，用活潑酯法將氟苯尼考人工半抗原與牛血清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)制備氟苯尼考人工抗原。紫外光譜法和光譜分析法對(duì)氟苯尼考人工抗原FFCHSBSA進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]與BSA和FFC相比， FFCHSBSA的最大吸收峰發(fā)生了變化，曲線形狀也發(fā)生了改變，F(xiàn)FC-HS與BSA的偶聯(lián)比為18.9∶1。[結(jié)論]FFC-HS-BSA人工抗原的合成是成功的，其偶聯(lián)比在最適范圍內(nèi)。

關(guān)鍵詞氟苯尼考；人工抗原；琥珀酸酐法；活潑酯法；偶聯(lián)比

中圖分類(lèi)號(hào)S859.84文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）23-07757-02

基金項(xiàng)目安徽科技學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目（ZRC201425）。

作者簡(jiǎn)介 孫素玲（1958-），女，安徽碭山人，教授，從事獸藥殘留檢測(cè)的研究。

收稿日期20140627氟苯尼考是酰胺醇類(lèi)第3代動(dòng)物專(zhuān)用抗菌藥，具有廣譜、高效、吸收好、體內(nèi)分布廣、無(wú)致再生障礙性貧血作用等特點(diǎn)，作為氯霉素的替代藥物被廣泛用于治療畜禽的細(xì)菌性疾病[1]，還用作豬的飼料添加劑來(lái)預(yù)防和治療豬的細(xì)菌性疾病[2]。研究表明，氟苯尼考具有胚胎毒性和耐藥性，在畜禽生產(chǎn)上的大量應(yīng)用也導(dǎo)致其在畜禽產(chǎn)品中殘留，危害公眾健康。歐盟、日本等國(guó)均制定了動(dòng)物食品中氟苯尼考的最大殘留量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告也對(duì)其殘留限量做出了嚴(yán)格規(guī)定。

目前，檢測(cè)動(dòng)物性食品中氟苯尼考?xì)埩舻臋z測(cè)方法主要是色譜分析法[3-4]和免疫分析方法（如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和ELISA試劑盒等）[5]。色譜分析法具有準(zhǔn)確、敏感的優(yōu)點(diǎn)，但也具有檢測(cè)需要時(shí)間長(zhǎng)、樣品前處理比較復(fù)雜、操作煩瑣、需要特殊的儀器、成本高等缺點(diǎn)。免疫分析法具有簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。動(dòng)物組織中氟苯尼考?xì)埩舻陌攵靠焖贆z測(cè)膠體金試紙條制備是屬于免疫分析方法，建立氟苯尼考?xì)埩裘庖叻治龇椒ㄗ铌P(guān)鍵的一步是氟苯尼考人工抗原的合成。筆者對(duì)氟苯尼考人工抗原進(jìn)行合成與鑒定，為氟苯尼考抗體的制備及動(dòng)物組織中氟苯尼考?xì)埩艨焖贆z測(cè)試紙條的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 主要試劑。氟苯尼考，純度≥99.0%，購(gòu)自武漢三洹醫(yī)藥化工有限公司；牛血清白蛋白（BSA），含量≥98%，購(gòu)自上海源聚生物科技有限公司；琥珀酸酐，AR級(jí)，含量≥99%，購(gòu)自陜西省渭南市惠豐化學(xué)工業(yè)有限責(zé)任公司；N，N二甲基甲酰胺（DMF），AR級(jí)，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；N羥基琥珀酰亞胺（NHS，含量≥99%），AR級(jí)，購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司。

1.1.2主要儀器。 YP600型電子天平，購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司； BCD502F型冰箱，購(gòu)自青島海爾冰箱股份有限公司；TLD802B型離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；752型紫外光分光光度計(jì)，購(gòu)自南京麒麟分析儀器有限公司；JB1A攪拌器（雷磁），購(gòu)自上海夢(mèng)漢實(shí)業(yè)有限公司。

1.2方法

1.2.1氟苯尼考人工抗原的制備。

1.2.1.1氟苯尼考-半琥珀酸酯（FFCHS）的制備[6]。參照文獻(xiàn)[6]方法，氟苯尼考（FFC） 6.0 g 、琥珀酸酐4.5 g攪拌溶于45 ml無(wú)水吡啶中， 60 ℃ 回流反應(yīng)24 h，旋轉(zhuǎn)蒸器中蒸去吡啶，用60 ml乙酸乙酯復(fù)溶蒸干物，轉(zhuǎn)至250 ml分液漏斗中， 待溶液分層后，用0.5 mol/L HCl 40 ml洗滌3次，三蒸水40 ml洗滌3次，得到橙紅色溶液。減壓濃縮上述溶液， 避光真空干燥48 h后得到粉紅色單酯粗品FFCHS。

1.2.1.2 FFCHS與BSA的偶聯(lián)（活潑酯法）[7]。參照文獻(xiàn)[7]的方法，用4 ml的N，N二甲基甲酰胺溶解500 mg的半抗原，再加入270 mg N羥基琥珀酰亞胺和460 mg N，N二環(huán)己基碳酰亞胺， 室溫避光攪拌24 h。將反應(yīng)液2 000 r/min 離心10 min， 棄去沉淀，上清液即為制備的氟苯尼考活化中間產(chǎn)物。將氟苯尼考活化中間產(chǎn)物在攪拌下逐滴加到含100 mg BSA的16 ml PBS中，攪拌1 h后轉(zhuǎn)至4 ℃下攪拌48 h。4 ℃攪拌下，用pH7.4的0.01 mol/L PBS透析，每8 h換液1次，透析2 d。2 000 r/min離心10 min，取上清液得到FFCHSBSA人工抗原。小量分裝，-20 ℃下保存。

1.2.2氟苯尼考人工抗原的鑒定。

1.2.2.1 FFCHSBSA溶液的蛋白濃度測(cè)定（雙縮尿法）[8]。根據(jù)文獻(xiàn)[8]的方法，將透析好的FFCHSBSA適當(dāng)稀釋后，測(cè)定在260和280 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，按照以下公式計(jì)算蛋白濃度：蛋白濃度（mg/ml）=1.45OD280 nm-0.74 OD260 nm。

1.2.2.2紫外光譜法鑒定FFCHSBSA人工抗原的合成。氟苯尼考在紫外區(qū)能產(chǎn)生明顯的吸收光譜。用PBS將BSA、透析好的FFCHSBSA均配成100 μg/ml質(zhì)量濃度，用甲醇溶解FFC配成100 μg/ml質(zhì)量濃度。 FFC用甲醇作參比，其余均用稀釋液PBS作參比，在200～400 nm紫外光區(qū)對(duì)FFCHSBSA溶液、BSA溶液和FFC溶液進(jìn)行光譜掃描，通過(guò)數(shù)據(jù)和圖譜的對(duì)比可證明偶聯(lián)成功與否。

1.2.2.3 FFCHSBSA人工抗原結(jié)合比的測(cè)定（光譜分析法）[9]。根據(jù)上述用紫外分光光度計(jì)測(cè)定出的FFC的最大吸收波長(zhǎng)，在FFC最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定FFCHSBSA和BSA的吸光度值，按照以下公式計(jì)算FFCHSBSA人工抗原結(jié)合比：

結(jié)合比=∑偶聯(lián)物-∑蛋白質(zhì)∑半抗原

=（A偶聯(lián)物-A蛋白質(zhì)）×C半抗原×M蛋白質(zhì)A半抗原×M半抗原×C蛋白質(zhì)

式中，A為吸光度；M為相對(duì)分子質(zhì)量；C為質(zhì)量濃度/（mg/ml）。

2 結(jié)果與分析

2.1氟苯尼考人工抗原的鑒定

2.1.1 FFCHSBSA溶液的蛋白濃度。經(jīng)雙縮尿法測(cè)定的FFCHSBSA中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為3.30 mg/ml。

2.1.2紫外光譜法鑒定FFCHSBSA人工抗原的合成。從可以看出，F(xiàn)FC在233 m波長(zhǎng)處有最大吸收峰，BSA在214 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰， FFCHSBSA在229 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。 FFCHSBSA與BSA和FFC相比，不但最大吸收峰發(fā)生了變化，曲線形狀也發(fā)生了改變，表明FFCHSBSA人工抗原的合成是成功的。

FFC、BSA和FFCHSBSA的紫外掃描圖譜2.1.3 FFCHSBSA人工抗原結(jié)合比。根據(jù)紫外掃描圖，F(xiàn)FC的最大吸收波長(zhǎng)為233.0 nm，在233.0 nm波長(zhǎng)處測(cè)定的FFCHSBSA與BSA的吸光度分別為1.077和0.44，計(jì)算出的BSA與半抗原的結(jié)合比為18.9∶1 。

3討論

人工抗原的合成在獸藥殘留的免疫分析方法中是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，人工抗原的質(zhì)量直接決定著抗體的效價(jià)和特異性[9]。FFC是半抗原，本身并不具備免疫原性，必須和載體蛋白偶聯(lián)才能成為完全抗原。FFC分子結(jié)構(gòu)中沒(méi)有與載體蛋白連接的功能性基團(tuán)氨基（-NH2）和羧基（-COOH），必須先將FFC分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造成具有氨基或者羧基。筆者利用FFC分子結(jié)構(gòu)上所帶的羥基（-OH），用琥珀酸酐作 “間隔臂”，將其改造成具有羧基（-COOH）的活性半抗原FFCHS。為了防止載體蛋白之間的交叉反應(yīng)，筆者選用BSA作為載體蛋白，用活潑酯法將FFCHS的羧基與載體蛋白BSA上的氨基相聯(lián)，合成含CONH鍵的FFCHSBSA人工抗原。

FFC與載體蛋白的偶聯(lián)效果如何將直接影響FFCHSBSA人工抗原的免疫效果，筆者利用紫外掃描法和FFCHS與載體蛋白之間的結(jié)合比測(cè)定對(duì)FCHSBSA偶聯(lián)效果進(jìn)行分析。紫外掃描法結(jié)果表明FFCHSBSA與BSA和FFC相比，不僅最大吸收峰發(fā)生了變化，而且曲線形狀也發(fā)生了改變，表明人工抗原FFCHSBSA的合成是成功的。人工抗原的特異性還與其載體蛋白上連接的半抗原數(shù)目有關(guān)。通常每個(gè)載體蛋白上含有8～25個(gè)半抗原時(shí)能取得較好的免疫效果[9-11]。筆者測(cè)定了FFCHSBSA人工抗原結(jié)合比，計(jì)算出BSA與FFCHS的結(jié)合比為18.9∶1，屬于最適結(jié)合比范圍之內(nèi)，從理論上來(lái)看應(yīng)該得到效價(jià)較高的抗體。筆者采用低速離心和透析來(lái)提高FFCHSBSA人工抗原的純度，離心除去變性的載體蛋白，用PBS對(duì)FFCHSBSA透析2 d，除去了未反應(yīng)的氟苯尼考、琥珀酸酯等小分子，保證了FFCHSBSA人工抗原的純度。

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