李福貴 鄒曙明

摘要[目的] 分析亞東鮭線粒體COⅠ與 COⅡ基因遺傳多樣性。[方法] 分別從西藏亞東河與亞東鮭養(yǎng)殖站采集野生與養(yǎng)殖亞東鮭各15尾樣品，對其線粒體DNA COⅠ、COⅡ基因全序列進行PCR擴增、測序比對。[結果]序列長度分別為631、634 bp。序列分析結果顯示：30條亞東鮭線粒體DNA COⅠ 、COⅡ序列分別檢測到1種、3種單倍型，均無堿基插入、缺失，COⅡ序列有2個位點出現(xiàn)堿基替換；COⅠ 、COⅡ序列T、C、A和G堿基平均含量分別為29.5%、28.97%，30.6%、28.47%，22.5%、27.03%和17.4%、15.53%，其中A+T的含量（52.0%、56.0%）均顯著高于G+C含量（48.0%、44.0%），均表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚；COⅠ 、COⅡ單倍型多態(tài)性（h）與核苷酸多態(tài)性（π） 值分別為0、0.80與0、0.000 1；根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型構建基于線粒體COⅠ、COⅡ序列的系統(tǒng)進化樹，兩亞東鮭魚遺傳距離分別為0、0.002 4。[結論]西藏亞東鮭的遺傳多樣性水平較低，且養(yǎng)殖和野生群體無遺傳分化。

關鍵詞亞東鮭；COⅠ基因；COⅡ基因；序列特征；遺傳機制；遺傳分化

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）23-07710-04

基金項目農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203086）；國家自然科學基金項目（31272633，31201760）；上海高校知識服務平臺（ZF1206）。

作者簡介李福貴（1987-），男，江西贛州人，博士研究生，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖學。*通訊作者。

收稿日期20140708亞東鮭（Salmo truttafraio Linne ）屬鮭形目、鮭科、鮭屬，又名河鮭，是分布于我國西藏地區(qū)的一種冷水性經(jīng)濟魚類，原產(chǎn)歐洲、非洲和西亞等地區(qū)，19世紀由英國人自歐洲引種，1992年被列入西藏自治區(qū)二級重點保護水生動物[1-6]。在西藏地區(qū)已有較大規(guī)模的亞東鮭人工養(yǎng)殖和繁殖。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，亞東鮭種質資源退化現(xiàn)象日趨嚴重。目前關于亞東鮭的研究主要涉及形態(tài)學、繁殖生物學和分子生物學等方面[4-11]。

筆者測定了2個群體亞東鮭（各15尾）COⅠ、COⅡ基因序列，分別與其他幾種鮭科魚類相同基因同源序列進行比對和分析、構建進化樹等，從基因水平上揭示自繁后代與野生群體的遺傳變異，以期通過分析2個種群的遺傳結構差異及多樣性，探討外來種在長期的高原環(huán)境壓力下是否會發(fā)生顯著性的遺傳變化、基因漂變，為合理保護和利用亞東鮭自然種質資源提供科學依據(jù)和指導，也為提高亞東鮭養(yǎng)殖性狀、培育優(yōu)良品種累積數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料所用30尾亞東鮭樣品分別來源于西藏亞東河和西藏自治區(qū)亞東鮭養(yǎng)殖站，大西洋鮭、紅點鮭、虹鱒COⅠ序列以及褐鱒、大鱗大麻哈魚、北極紅點鮭和虹鱒COⅡ序列均來自于GenBank，具體采樣信息見。魚鰭樣品均用無水乙醇固定，于-20 ℃冰箱保存。

1.2 COⅠ、COⅡ引物序列用于擴增亞東鮭COⅠ、COⅡ基因片段的通用引物由上海生工（Sangon）合成，引物序列YDCOⅠ-F：5TCA ACC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC3；YDCOⅠ-R：5TAG ACT TCT GGG TGG CCA AAG AAT CA3；YDCOⅡ-F：5ATGGCACATCCCTCACAACTAGGATT3；YDCOⅡ-R：5AGGCATCTTCAAGTAGGATAGTGGATCA3。

1.3 基因組DNA提取、PCR擴增和測序試驗前將魚鰭從乙醇中取出，用蒸餾水洗凈、吸水紙吸干、剪碎，按照海洋動物組織DNA抽提法（天根試劑盒）提取基因組DNA。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提DNA的質量和濃度。稀釋DNA到合適濃度用于PCR擴增。選取6組退火溫度（53、54、55、56、57、58 ℃）進行梯度PCR，最終確定55、56 ℃分別為最佳退火溫度。PCR反應體積為50 μl，程序為：95 ℃預變性5 min，然后35循環(huán)（95 ℃變性35 s，54 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min）72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。以上反應均設置陰性對照排除DNA污染。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工完成測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析將雙向測序獲得的序列進行拼接，然后在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast同源性搜索，經(jīng)驗證確定為基因序列結果。利用MEGA 4.10軟件進行序列排列，同時輔以人工較對，并進行序列比較和變異檢測，確定變異位點和單倍型，采用DNA SP4.10軟件計算單倍型多樣性（Haplotype diversity，Hd）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，Pi）和核苷酸歧異度（ Pairwise divergence）。用Arlequin3.01軟件中的分子變異分析（AMOVA ） 方法估算遺傳變異在群體間和群體內的分布，并計算群體間遺傳分化系數(shù)（F-statistics，F(xiàn)st） 及其顯著性（重復次數(shù)1 000），群體間基因流計算公式：Nm=（1/Fst-1）/2。對測得序列堿基組成及序列間堿基替代數(shù)、差異位點進行統(tǒng)計分析，基于Kimura雙因子參數(shù)模型構建NJ樹，分析鮭科魚類種間親緣關系，并對所得系統(tǒng)樹進行自展法檢驗1 000次重復。

2 結果與分析

2.1 COⅠ、COⅡ序列同源分析及變異位點比較PCR 擴增得到野生與自繁F1后代養(yǎng)殖亞東鮭30個個體清晰的COⅠ、COⅡ擴增帶。經(jīng)測序比對分別得到631、634 bp基因片段。與GenBank中其他鮭科魚類mtDNA COⅠ、COⅡ序列進行Blast比對，相同基因片段的同源性分別達96%、92%以上。

種鮭科魚類COⅡ基因片段變異位點比較30條COⅠ序列僅檢測到1種單倍型，沒有出現(xiàn)堿基的插入、缺失、替換。與大西洋鮭、紅點鮭及虹鱒同源序列比對得到613 bp比對位點。35條同源序列共發(fā)現(xiàn)6種單倍型，其中野生和養(yǎng)殖亞東鮭30個體序列完全相同，共享一種單倍型。30條COⅡ序列檢測到3種單倍型（野生2種，養(yǎng)殖1種），沒有出現(xiàn)堿基的插入與缺失。與大西洋鮭及紅點鮭COⅡ同源序列比對得到620 bp比對位點，共檢測到92條（14.8%）變異位點。35條同源序列共發(fā)現(xiàn)8種單倍型，其中野生和養(yǎng)殖亞東鮭30個體序列有個別堿基差異，各有2種和1種單倍型，用ysyd1、ysyd2與yzyd表示；褐鱒2個體存在2種單倍型，用a1-2表示；大鱗大麻哈魚1個體存在1種單倍型，用b1表示；北極紅點鮭1個體存在1種單倍型，用c1表示；虹鱒1個體存在1種單倍型，用d1表示（）。

2.2 鮭科魚類COⅠ、COⅡ堿基組成比較利用MEGA 5.05 軟件分析COⅠ、COⅡ堿基組成見～3。從堿基組成的偏向性來看，G含量最低，A+T含量大于C+G含量，表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚，且鮭科魚類COⅠ、COⅡ序列堿基含量特征均高度相似，這與脊椎動物線粒體DNA的特點相一致[12]。

2.3 亞東鮭種群COⅠ、COⅡ序列遺傳多樣性分析用MEGA5.05軟件確定30個亞東鮭樣本COⅠ、COⅡ序列單倍型，同時統(tǒng)計單倍型及多態(tài)位點（s），計算單倍型多樣性（h）、平均核苷酸差異數(shù) （k） 及核苷酸多樣性（π） （）。COⅠ 沒有變異位點，單倍型多態(tài)性與核苷酸多態(tài)性值均為0；COⅡ 鮭科魚類COⅠ堿基組成的比較

種名堿基含量∥%TCAGA+TG+C野生亞東鮭29.530.622.517.452.048.0大西洋鮭31.728.722.417.254.145.9大西洋鮭31.029.222.916.953.946.1大西洋鮭31.529.022.517.054.046.0紅點鮭 29.229.423.018.452.247.8虹鱒 29.629.622.618.252.247.8平均30.329.622.617.552.947.1

鮭科魚類COⅡ堿基組成的比較

序列共檢測到2個多態(tài)位點，占分析位點總數(shù)的0.3%，單倍型多態(tài)性為0.978，核苷酸多態(tài)性為0.000 1。 亞東鮭線粒體COⅠ、COⅡ序列遺傳多樣性參數(shù)

類群樣本數(shù)亞東鮭線粒體COⅠ單倍

型數(shù)單倍型

多樣性多態(tài)

位點平均核苷

酸差異數(shù)核苷酸多

樣性指數(shù)亞東鮭線粒體COⅡ單倍

型數(shù)單倍型

多樣性多態(tài)

位點平均核苷

酸差異數(shù)核苷酸多

樣性指數(shù)養(yǎng)殖151000010000野生151000020.93310.066 670.000 1總體301000030.97820.066 670.000 1

2.4 鮭科魚類COⅠ、COⅡ遺傳距離及系統(tǒng)進化關系根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型構建基于亞東鮭魚COⅠ序列構建的系統(tǒng)進化樹（），得到5種鮭科魚類遺傳距離，其中野生和養(yǎng)殖亞東鮭共30尾序列完全相同，在進化樹上位于同一位置。而與大西洋鮭、紅點鮭、虹鱒遺傳距離為0.03～0.06，彼此之間距離均大于種間鑒定最小遺傳距離（2%）[7]。說明野生和養(yǎng)殖亞東鮭基本無分化。

根據(jù)COⅠ基因序列構建的NJ 系統(tǒng)樹根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型構建基于亞東鮭魚COⅡ序列構建的系統(tǒng)進化樹（），得到5種鮭科魚類遺傳距離，其中亞東鮭與褐鱒遺傳距離最小，均小于0.002 4；與北極紅點鮭遺傳距離最大，為0.054 2；亞東鮭與大鱗大馬哈魚、虹鱒遺傳距離分別為0.031 2、0.039 0。結果顯示，野生型和養(yǎng)殖型交錯在一起，未表現(xiàn)出明顯差異，說明野生和養(yǎng)殖亞東鮭基本無分化。

安徽農(nóng)業(yè)科學2014年根據(jù)COⅡ基因序列構建的NJ 系統(tǒng)樹3結論與討論

3.1 線粒體 COⅠ序列同質性該研究結果顯示，COⅠ基因在野生和自繁F1后代養(yǎng)殖亞東鮭種群之間無任何差異。這種同質性可能是由于一個相似的亞分化[13]造成的，而這種同質性產(chǎn)生原因可能是由2個種群內在的親緣關系。亞東鮭魚引入我國西藏后，在高原環(huán)境下繁衍生殖了100多年，隨著人工捕撈和自然災害的頻頻發(fā)生，自然選擇壓力之下野生種群數(shù)量勢必下降。人工繁殖的親魚均是從河中捕撈引進，它們大多數(shù)個體是同一尾或者幾尾雌魚產(chǎn)生的后代。另外對野生和養(yǎng)殖的30尾魚COⅠ基因測序，沒有檢測到不同的單倍形個體。這表明亞東鮭還沒有達到在線粒體 DNA水平的較大變異。

3.2 亞東鮭COⅡ序列差異序列沒有發(fā)生任何堿基的插入和缺失，A、T、C、G 4種核苷酸在線粒體基因組中的分布呈不均一性，是動物線粒體基因組的一個共性[14]。該研究所得到的亞東鮭COⅡ區(qū)中，A+T的含量（56%）顯著高于G+C含量（44%），這與其他魚類線粒體COⅡ基因序列結果類似[15]，也與邵愛華等[16]統(tǒng)計的15種魚類堿基平均組成相似，表明A+T含量高可能也是魚類mtDNA COⅡ基因堿基組成中普遍存在的現(xiàn)象。在DNA進化過程中，堿基轉換（TS）發(fā)生的頻率高于顛換（TV），該研究結果與此相符。

該試驗樣本來自于西藏自治區(qū)亞東鮭養(yǎng)殖站，其親本來源于亞東河，系多代養(yǎng)殖品種。擴增的30尾亞東鮭COⅡ序列幾乎完全相同，只有2個位點出現(xiàn)堿基變異，這可能與其長期近親繁殖導致種質資源退化遺傳多樣性降低有關。

3.3 亞東鮭群體COⅠ、COⅡ的遺傳多樣性水平 核苷酸多態(tài)性（Pi）和單倍型平均遺傳距離（P）是衡量一個種群mtDNA遺傳變異的2個重要指標。其中Pi考慮了各種mtDNA單倍型在群體中所占的比例，所以在反映一個群體的mtDNA多態(tài)程度時往往比單純的遺傳距離平均值更精確[17]。該研究結果顯示，基于線粒體COⅠ基因片段亞東鮭群體均具有較低的核苷酸多樣性（Pi<0.005） 和較低的單倍型多樣性（Hd<0.8），而基于線粒體COⅡ基因片段，亞東鮭群體均具有較低的核苷酸多樣性（Pi<0.005） 和較高的單倍型多樣性（Hd >0.8），因此筆者分析得出亞東鮭養(yǎng)殖群體和自繁F1后代野生群體均具有較低的遺傳多樣性水平，這與其他物種養(yǎng)殖群體較低的遺傳多樣性結果一致，說明該研究中的亞東鮭受人工養(yǎng)殖環(huán)境的及近親繁殖等影響，養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)輕微衰退，同時也預示著保護亞東鮭遺傳多樣性工作的重要性。

進行物種間鑒定的重要標志是種內和種間遺傳距離的大小，較大的種間差異是對物種進行準確鑒定的先決條件。加拿大動物學家推薦物種鑒定最小種間遺傳距離為2%，COⅠ序列系統(tǒng)進化樹顯示，野生和自繁F1后代養(yǎng)殖亞東鮭共30尾序列完全相同，遺傳距離相同，在進化樹上位于同一位置，而與大西洋鮭、紅點鮭、虹鱒遺傳距離為0.03～0.06，彼此之間距離均大于種間鑒定最小遺傳距離（2%）[7]。說明野生和養(yǎng)殖亞東鮭基本無分化。COⅡ序列系統(tǒng)進化樹顯示，褐鱒與亞東鮭魚間遺傳距離均小于0.002 4，說明褐鱒即棕鱒、亞東鮭是其亞種；而亞東鮭與大鱗大麻哈魚、虹鱒、北極紅點鮭魚間遺傳距離為0.029 4～0.054 2，大于2%這一臨界值，表明利用COⅡ基因序列片斷可以有效地進行這幾種鮭科魚類物種的鑒定。

綜上，該研究中的亞東鮭養(yǎng)殖群體和野生群體均具有較低的遺傳多樣性，因此，筆者建議種苗繁育場在進行人工繁殖時，盡量采用多種來源及遺傳距離較遠的不同親魚群體進行繁殖，避免近交衰退帶來的風險，從而有利于豐富亞東鮭苗種的遺傳多樣性。

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