王麗　閆春生　賈安　信建豪 黃濤

摘要

[目的]用高效液相色譜法（HPLC）考察5個(gè)不同產(chǎn)地女貞葉中熊果酸的含量。[方法]用高效液相色譜法所用色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。[結(jié)果]方法學(xué)考察結(jié)果，回歸方程為Y=4.715 5X+17.918，R2=0.999 4，熊果酸含量在5.21～125.12 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。用該方法測(cè)得5個(gè)不同產(chǎn)地女貞葉中熊果酸的含量存在差異，其中上海市產(chǎn)的含量最高，為2.157 4 mg/g，南陽(yáng)唐河產(chǎn)的含量最低，為0.863 0 mg/g。[結(jié)論]同一采集時(shí)間，不同產(chǎn)地的女貞葉因環(huán)境因素，所含熊果酸的含量差異較大。

關(guān)鍵詞女貞葉；熊果酸；HPLC；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）28-09738-02

Determination of the Content of Ursolic Acid in Folium Ligustrum lucidus from Different Habitats by HPLC

WANG Li， YAN Chunsheng， JIA An et al（Huanghe Science and Technology College， Zhengzhou， Henan 450006）

Key words[Objective] The content of ursolic acid in folium Ligustrum lucidus from different habitats was investigated by HPLC. [Method] Chromatographic column is eighteen alkyl silane bonded silica gel column chromatography （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， the mobile phase is acetonitrilemethanol-0.5% ammonium acetate （67∶12∶21）， the detection wavelength is 210 nm. [Result] Methodological study results： the regression equation： Y=4.715 5X+17.918， R2=0.999 4， the content of ursolic acid in 5.21-125.12 μg/ml， the concentration of the linear relationship is good. The content of ursolic acid in folium Ligustrum lucidus from different habitats existis differences， the highest content of Shanghai produced is up to 2.157 4 mg/g， the lowest content produced in Nanyang Tanghe is 0.863 0 mg/g. [Conclusion] At the same acquisition time， the content of ursolic acid in folium Ligustrum lucidus from different habitats has significant differences because of environmental factors.

Key wordsLigustrum lucidus； Ursolic acid； HPLC； Content determination

女貞葉為木犀科植物女貞Ligustrum lucidus Ait.的葉[1]，又名冬青葉、土金剛?cè)~、爆竹葉[2]。 民間常用鮮女貞葉咀嚼慢咽的方法治療口腔潰瘍[3-4]?！吨兴幋筠o典》載有女貞葉性平、味微苦、無(wú)毒，具有祛風(fēng)、明目、消炎消腫、祛瘀散結(jié)、生肌止痛及收斂防腐之功效。在民間應(yīng)用很廣，主要用于滋陰止血[5-6]。但目前，關(guān)于女貞葉沒(méi)有相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為了更好地開(kāi)發(fā)應(yīng)用，筆者特對(duì)其主要有效成分之一熊果酸的測(cè)定方法進(jìn)行考察，并選取5個(gè)不同產(chǎn)地的女貞葉，對(duì)其熊果酸的含量進(jìn)行比較，為女貞葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

樣品采自鄭州市、上海市、新鄉(xiāng)市、南陽(yáng)唐河縣、焦作武陟縣5個(gè)不同地區(qū)，分別編號(hào)20130801、20130802、20130803、20130804、20130805。經(jīng)藥學(xué)教研室李勉教授鑒定為木犀科植物女貞Ligustrum lucidus Ait.的葉。8月底采摘，清洗干凈，陰干，粉碎，過(guò)50目篩，備用。以鄭州市采集的女貞葉（編號(hào)20130801）為主要對(duì)象進(jìn)行研究。

1.2試劑

乙醇、乙酸銨（試劑均產(chǎn)自天津市分船化學(xué)試劑科技有限公司）為分析純；乙腈、甲醇為色譜純；熊果酸對(duì)照品（批號(hào)為110742—200313，供含量測(cè)定用）由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.3試驗(yàn)儀器

Agilent 1200 LC 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，生命科學(xué)與化學(xué)分析儀器部）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；超聲儀KQ5200M（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；微孔濾膜（0.45 μm）水膜和有機(jī)膜。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1

色譜條件。色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μl。

1.4.2

對(duì)照品溶液制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

精密稱取熊果酸10 mg，加75%乙醇制成濃度為0.25 mg/ml的對(duì)照品溶液，搖勻，即可。精密量取儲(chǔ)備液相應(yīng)量，然后用75%乙醇依次稀釋對(duì)照品溶液，其濃度分別為 5.21、10.42、20.82、41.64、93.28、125.12 μg/ml，分別進(jìn)樣20 μl，記錄測(cè)定峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3

供試品溶液制備。

取樣品粉末各1 g，精密稱定置10 ml具塞錐形瓶中，加入75%乙醇10 ml，超聲提取30 min置于室溫中放冷后，加入75%乙醇定容，搖勻，濾過(guò)取續(xù)濾液，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后作為供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)照品與樣品的高效液相色譜峰圖

從圖1可以看出，在相同的色譜條件下，樣品在對(duì)照品相同的出峰時(shí)間（t=12.9 min）也有一個(gè)峰出現(xiàn)，說(shuō)明該峰即為樣品中熊果酸的峰，且該條件下樣品中熊果酸的峰與相鄰峰的分離度較大，說(shuō)明此條件適合該樣品測(cè)定熊果酸。

2.2 對(duì)照品溶液制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖2可見(jiàn)，其回歸方程為Y=4.715 5X+17.918（R2=0.999 4），表明熊果酸含量在5.21～125.12 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別在0、1、2、4、8 h進(jìn)樣20 μl，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0、1、2、4、8 h進(jìn)樣測(cè)得同一樣品中酸果酸的峰面積分別為1 832.40、1 814.60、1 640.00、1 638.20、1 765.98，其RSD為4.8%，表明該樣品中熊果酸在8 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

圖1 對(duì)照品（a）和樣品（b）熊果酸的HPLC圖譜

圖2 對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度試驗(yàn)

通過(guò)取對(duì)照品溶液（熊果酸0.25 mg/ml）重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣20 μl，測(cè)定對(duì)照品的峰面積分別為2 197.43、2 098.64、2 057.08、2 106.09、2 027.22，其RSD值為2.7%，表明所用儀器精密度良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已測(cè)知熊果酸含量的女貞葉供試品6份，分別精密加入熊果酸0.7 mg，按照“1.4.3”項(xiàng)方法進(jìn)行提取和含量測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），熊果酸的平均加樣回收率為95.01%，RSD為0.2%。符合相關(guān)要求。

2.6 樣品含量測(cè)定

精密稱定5個(gè)產(chǎn)地的女貞葉樣品各3份，按照“1.4.3”項(xiàng)下樣品處理，得供試液，20 μl注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算供試品中熊果酸的含量。由表2可見(jiàn)，不同產(chǎn)地，女貞葉中熊果酸的含量差異較

大。其中上海市產(chǎn)的女貞葉中熊果酸含量最高，為2.157 4

mg/g；其次是新鄉(xiāng)市產(chǎn)的女貞葉，含量為2.027 3 mg/g；鄭州市產(chǎn)的女貞葉含量為1.570 7 mg/g；焦作武陟縣產(chǎn)的女貞葉含量是1.067 mg/g；南陽(yáng)唐河縣產(chǎn)的女貞葉中熊果酸含量最低，為0.863 0 mg/g。

3 結(jié)論

（1）通過(guò)對(duì)HPLC法的方法學(xué)進(jìn)行考察，結(jié)果得到回歸方程為Y=4.715 5X+17.918（R2=0.999 4），熊果酸含量在5.21～125.12 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；且樣品穩(wěn)定，儀器精密度和樣品的加樣回收率均達(dá)到了相關(guān)要求，說(shuō)明該方法靈敏、可靠、準(zhǔn)確。

（2）通過(guò)對(duì)選取的5個(gè)不同產(chǎn)地的女貞葉中熊果酸的含量進(jìn)行分析計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)女貞葉中熊果酸的含量差異較大。其中，上海市產(chǎn)的女貞葉中熊果酸含量最高，為2.157 4 mg/g，南陽(yáng)唐河縣產(chǎn)的女貞葉中熊果酸含量最低，為0.863 0 mg/g，說(shuō)明不同產(chǎn)地因溫度、水分、土壤等不同，藥材中的化學(xué)成分的含量存在差異。這也為女貞葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

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