張西軒　李曄　阮海華

摘要 [目的]構建人泛素結合酶UbcH5c的活性位點突變體S22R和F62A，同時分析這2種突變體蛋白與野生型蛋白在泛素化反應中的活性差異。[方法]通過點突變（Site-Directed Mutagenesis）的方法構建2種突變體質粒，利用0.5 mmol/L IPTG分別誘導2種突變體蛋白在大腸桿菌中進行表達；將菌體超聲破碎后，依次利用陽離子交換層析法對UbcH5c突變蛋白進行分離純化，最后利用體外泛素化酶促反應結合蛋白免疫印跡雜交的方法分析野生型UbcH5c與其活性突變體UbcH5c S22R和UbcH5c F62A在泛素化修飾上的差異。[結果]人泛素結合酶UbcH5c的2個突變體蛋白S22R、F62A的泛素化修飾程度明顯弱于野生型蛋白。[結論]突變體S22R和F62A突變均不同程度的改變了人泛素結合酶UbcH5c與泛素分子之間的結合活性，即2個突變的位點中第62位苯丙氨酸殘基及第22位絲氨酸殘基均是UbcH5c結合泛素的關鍵位點，而且后者對于UbcH5c結合泛素活性的影響更大。

關鍵詞 UbcH5c；泛素化修飾；點突變

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）03-00663-04

蛋白的泛素化修飾包括以下3個步驟：（1）泛素的活化：泛素甘氨酸端的羧基連接到泛素活化酶E1（Ubiquitin activating enzyme）的巰基，這個步驟需要以ATP作為能量，最終形成一個泛素和泛素活化酶E1之間的硫酯鍵；（2）E1將活化后的泛素通過交酯化過程交給泛素結合酶E2（Ubiquitin conjugating enzyme）；（3）泛素連接酶E3將結合在E2上的泛素分子連接到底物蛋白上，最終，底物蛋白被泛素化修飾[1-3]。UbcH5c是泛素結合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）家族中的成員，由147個氨基酸構成，分子量約為16 kDa[4]。在泛素介導的泛素化反應途徑中泛素活化酶（E1）將活化后的泛素分子通過交酯化過程呈遞給UbcH5c，泛素分子結合于UbcH5c的第85位半胱氨酸（Cys85）形成UbcH5c-Ub復合物，其中Cys85是UbcH5c的活性催化中心的氨基酸[5]。研究發(fā)現，在泛素化級聯反應中，除了UbcH5c通過巰酯鍵與泛素分子之間形成復合物以外，其他的氨基酸在該復合物的形成過程中也發(fā)揮重要作用，例如第22位的絲氨酸（Ser，S）和第62位的苯丙氨酸[6]。筆者通過點突變（Site-Directed Mutagenesis）的方法分別構建2種UbcH5c的活性突變體UbcH5c S22R、UbcH5c F62A；其中，UbcH5c S22R為野生型UbcH5c的氨基酸序列上第22位的絲氨酸（Ser，S）改變?yōu)榫彼幔ˋrg，R）；UbcH5c F62A為野生型UbcH5c的氨基酸序列上第62位的苯丙氨酸（Phe，F）改變?yōu)楸彼幔ˋla，A）；并利用體外泛素化酶促反應與蛋白免疫印跡的方法分析野生型UbcH5c及其2個突變體在泛素化反應中活性的差異，以期為UbcH5c活性突變體的的開發(fā)利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和質粒載體。感受態(tài)大腸桿菌E.coli Trans10、E.coli BL21（DE3）、重組質粒pET21a-UbcH5c，由實驗室保存。

1.1.2 主要試劑。Vent DNA polymeras，購自美國NEB公司；T4 DNA連接酶，購自美國 Promega公司；PVDF膜，購自德國Milipore公司；質粒小提中量試劑盒，購自北京天根公司；鼠源UbcH5c單克隆抗體，購自Abcam公司；鼠源HRP偶聯抗體，購自Promega公司；ECL化學發(fā)光底物試劑盒，購自Thermo Scientific；其他試劑為國產分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 人泛素結合酶UbcH5c點突變體的構建。人泛素結合酶UbcH5c突變體的構建采用Site-directed Mutagenesis Kit 的方法，即根據NCBI數據庫公布的人泛素結合酶UbcH5c的基因編碼序列（GenBank號為U39318.1）分別設計2對互補的引物（如表1所示）構建突變體質粒[5]。質粒構建采用PCR的方法，反應條件為 94 ℃，6 min；94 ℃，30 s，78 ℃，30 s，72 ℃，10 min，16個循環(huán)；72 ℃，15 min。取20 μl PCR產物利用DpnI于37 ℃下酶切1 h，酶切后的產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增成功，再將酶切產物轉化到大腸桿菌Trans 10 感受態(tài)細胞中，涂布于含Ampr的LB平板上，37 ℃條件下培養(yǎng)12～16 h。挑取單個菌落接種于含Ampr的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提取質粒后進行測序驗證。

2.4 人泛素結合酶UbcH5c及其2種突變體UbcH5c S22R、UbcH5c F62A泛素結合活性分析 圖6表明，野生型UbcH5c具有最強的泛素結合活性，其UbcH5c-Ub復合物的生成量最多。相比之下，突變體UbcH5c S22R的泛素結合活性明顯弱于野生型UbcH5c，且生成的UbcH5c-Ub復合物也偏少。而突變體UbcH5c F62A的泛素結合活性幾乎完全喪失，不能夠與泛素分子之間形成UbcH5c-Ub復合物。結果表明，人泛素結合酶UbcH5c中第22位的絲氨酸與第62位的苯丙氨酸的單獨突變均明顯削弱了UbcH5c與泛素分子的結合活性；且與第22位的絲氨酸相比，第62位的苯丙氨酸位點對于其與泛素分子結合至關重要。

3 結論與討論

試驗利用定點突變的方法構建了人泛素結合酶UbcH5c的2株突變體蛋白，分別為S22R和F62A。通過與野生型蛋白進行比較發(fā)現，S22以及F62的突變直接導致UbcH5c與泛素分子之間非共價結合作用明顯降低，表明這2個位點與UbcH5c和泛素分子之間非共價結合直接相關。泛素結合酶是泛素化修飾途徑中的核心組件之一，且可以將活化的泛素分子從泛素活化酶上轉移到特定的泛素連接酶上[7-9]。研究表明，人泛素結合酶UbcH5c與泛素的結合包括2種方式，一種為其第85位的半胱氨酸與泛素分子的共價結合，另一種為其與泛素分子的非共價結合。人泛素結合酶UbcH5c與泛素分子的非共價結合對泛素的成鏈具有重要作用，為了研究人泛素結合酶UbcH5c與泛素分子之間的非共價結合。Brzovic等在蛋白質的分子水平上，利用核磁共振成像等手段對人泛素結合酶UbcH5c與泛素通過非共價結合形成的復合物進行了研究[6]。結果表明，人泛素結合酶UbcH5c可以識別并非共價的結合泛素分子上第8位的亮氨酸、第44位的異亮氨酸以及第70位的纈氨酸，這種與泛素分子之間非共價的結合主要集中在人泛素結合酶UbcH5c上遠離其半胱氨酸（Cys85）殘基的β折疊鏈1-3上，其中距離最近的非共價結合位點也超過了20個氨基酸的長度，且一個泛素分子不能同UbcH5c Cys85殘基以及非共價結合位點同時結合。當UbcH5c的非共價結合位點S22與F62被突變后，人泛素結合酶UbcH5c的泛素化修飾程度變得異常微弱與緩慢。

參考文獻

[1] YE Y，BLASER G，HORROCKS M H，et al.Ubiquitin chain conformation regulates recognition and activity of interacting proteins[J].Nature，2012，492（7428）：266-270.

[2] HOCHSTRASSER M.Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly[J].Cell，2006，124（1）：27-34.

[3] ZINNGREBE J，MONTINARO A，PELTZER N，et al.Ubiquitin in the immol/Lune system[J].EMBO Rep，2014，15（1）：28-45.

[4] SOSS S E，KLEVIT R E，CHAZIN W J.Activation of UbcH5c～Ub is the result of a shift in interdomain motions of the conjugate bound to U-box E3 ligase E4B[J].Biochemistry，2013，52（17）：2991-2999.

[5] PAGE R C，PRUNEDA J N，AMICK J，et al.Structural insights into the conformation and oligomerization of E2～ubiquitin conjugates[J].Biochemistry，2012，51（20）：4175-4187.

[6] BRZOVIC P S，LISSOUNOV A，CHRISTENSEN D E，et al.A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination[J].Molecular Cell，2006，21（6）：873-880.

[7] FRACCALVIERI D，SOSHILOV A A，KARCHNER S I，et al.Comparative Analysis of Homology Models of the Ah Receptor Ligand Binding Domain：Verification of Structure–Function Predictions by Site-Directed Mutagenesis of a Nonfunctional Receptor [J].Biochemistry，2013，52（4）：714-725.

[8] HERRADOR A，LEON S，HAGUENAURE-TSAPIS R，et al.A mechanism for protein monoubiquitination dependent on a trans-Acting ubiquitin-binding domain[J].Journal of Biological Chemistry，2013，288（23）：16206-16211.

[9] RONCHI V P，KLEIN M，HAAS A L.E6AP/UBE3A ubiquitin ligase harbors two E2 ubiquitin binding sites [J].Journal of Biological Chemistry，2013，288（15）：10349-10360.