李曄　張西軒　阮海華

摘要 [目的]研究沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB中跨膜疏水結(jié)構(gòu)域288-309肽段對(duì)受SopB誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞Akt磷酸化激活中的功能。[方法]通過重疊延伸PCR的方法構(gòu)建SopB第288～309位肽段缺失突變基因，并將該基因在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行異位表達(dá)，與野生型SopB基因進(jìn)行比較，確定缺失的第288～309位間肽段在受SopB誘導(dǎo)的Akt磷酸化激活中的作用。[結(jié)果]與空載體對(duì)照相比較，在HeLa細(xì)胞中表達(dá)野生型SopB重組質(zhì)粒明顯激活了pAkt473的磷酸化，而在HeLa細(xì)胞中表達(dá)SopB缺失突變體SopBΔ288-309時(shí)，則檢測(cè)不到pAkt473的磷酸化激活。[結(jié)論]SopB表達(dá)激活HeLa細(xì)胞pAkt473的磷酸化與其第288～309位肽段的功能直接相關(guān)，該跨膜疏水結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致SopB蛋白不能亞細(xì)胞定位至細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致SopBΔ288-309對(duì)pAkt473磷酸化激活功能的喪失。

關(guān)鍵詞 沙門氏菌屬；SopB；AKT的磷酸化

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）03-00660-03

沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB 是由沙門氏菌SPI-1 Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的一種由561個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子，是一種肌醇磷脂酶，是目前沙門氏菌分泌的效應(yīng)蛋白中研究最多、功能最多樣化的一個(gè)蛋白[1-5]。沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB 首先作用于質(zhì)膜，激活SH3-鳥核苷酸交換因子（SGEF），間接活化交換因子RhoG，從而進(jìn)一步激活肌動(dòng)蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排，促使沙門氏菌侵入宿主細(xì)胞[6]。沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB 能夠激活原癌基因Akt473 的磷酸化，對(duì)細(xì)菌入侵介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有抑制作用，促進(jìn)宿主細(xì)胞的存活，為沙門氏菌在宿主細(xì)胞中的存活提供條件[7]。同時(shí)，SopB 通過招募RAB5 和VPS34 到SCV（Salmonella-Containing Vacuole，SCV），促進(jìn)SCV在宿主細(xì)胞內(nèi)的形成和成熟，這對(duì)沙門氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活與復(fù)制具有重要的意義[8]。研究表明，沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB在感染宿主細(xì)胞后能夠發(fā)生泛素化修飾，該泛素化修飾在沙門氏菌感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要的作用[9-10]。利用結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)算法（TMpred prediction algorithm）軟件分析發(fā)現(xiàn)沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB 第288～309位氨基酸之間的肽段擁有較強(qiáng)的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域。該跨膜結(jié)構(gòu)域被證實(shí)與效應(yīng)蛋白SopB的泛素化修飾直接相關(guān)[9]。為了深入研究該SopB跨膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域在沙門氏菌感染過程中是否與受SopB誘導(dǎo)的Akt的磷酸化修飾和激活有關(guān)，筆者利用重疊延伸PCR的方法構(gòu)建SopB基因第288～309位肽段缺失的突變體，即SopBΔ288-309缺失突變體，并與野生型SopB蛋白的功能進(jìn)行比較，以期確定該肽段與受SopB誘導(dǎo)的Akt的磷酸化修飾和激活之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、宿主細(xì)胞和質(zhì)粒載體。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium LT2）、大腸桿菌（Ecoli）Trans 10、pCDNA4.0質(zhì)粒載體、pCDNA4-SopB重組質(zhì)粒和HeLa細(xì)胞，均由天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑。質(zhì)粒DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒，購自英國Omega公司；Vent DNA polymerase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ，均購自美國NEB公司；T4 DNA連接酶，購自美國Promega公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Vigofect，購自威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司；引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pcDNA4-SopBΔ288-309突變體的構(gòu)建。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的Salmonella Typhimurium str.LT2的SopB基因編碼序列（GenBank號(hào)為AE006468.1），利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物（表1）。以pCDNA4-SopB重組質(zhì)粒為模板，分別利用P1、P3引物對(duì)以及P2、P4引物對(duì)擴(kuò)增編碼SopB 0～288蛋白的基因片段以及編碼SopB 309～561蛋白的基因片段。2個(gè)片段進(jìn)行PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件均為：94 ℃，6 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并分別回收純化 PCR 產(chǎn)物。最后利用P1、P2引物對(duì)，以等量的上述2種PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增SopBΔ288-309缺失突變體編碼基因。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，6 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收純化 PCR 產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切并純化酶切后的片段，同時(shí)將質(zhì)粒 pCDNA4.0也經(jīng)同樣雙酶切和純化。最后，將pCDNA4與SopBΔ288-309基因片段的酶切純化產(chǎn)物用 T4 連接酶體系連接，轉(zhuǎn)化 Trans 10 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含 Ampr的 LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單個(gè)菌落接種于含 Ampr的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩過夜，酶切鑒定，獲得pCDNA4-SopBΔ288-309重組質(zhì)粒，測(cè)序確認(rèn)插入序列正確。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。參照的方法[11-12]。

1.2.3 HeLa細(xì)胞pAKT473激活情況的檢測(cè)。參照文獻(xiàn)的方法[13]，收集分別轉(zhuǎn)染pCDNA4-SopB野生型質(zhì)粒和pCDNA4-SopBΔ288-309突變體質(zhì)粒24 h后的HeLa細(xì)胞，將細(xì)胞加等體積2×SDS載樣緩沖后，沸水浴煮沸5 min，離心1 min后進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，利用兔源抗pAkt473的一抗和羊抗兔二抗進(jìn)行免疫印跡雜交，洗膜，最后通過ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行X光片壓片，洗片。同時(shí)利用Akt抗體作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 SopBΔ288-309突變基因的擴(kuò)增 利用pCDNA4-SopB重組質(zhì)粒作為模板，分別以P1、P3引物對(duì)和P2、P4引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增成功獲得編碼SopB 0～288蛋白序列的基因片段（圖1泳道1、2、3和4）以及SopB 309～561蛋白序列的基因片段（圖1泳道5、6、7和8）。從圖中可以看出，2種PCR片段的長度均在DNA marker的大小為750 bp的條帶附近，而且編碼SopB 0～288蛋白片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量（預(yù)期片段長度 864 bp）比編碼SopB 309～561蛋白片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量（預(yù)期片段長度 756 bp）略大一些，與預(yù)期結(jié)果相吻合。繼續(xù)以上述2種回收的PCR片段作模板，利用引物對(duì)P1、P2對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，成功擴(kuò)增出了與預(yù)期的SopBΔ288-309片段長度（1 620 bp）接近的PCR產(chǎn)物（圖2）。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過重疊延伸PCR的方法即利用2種PCR片段作為模板，2個(gè)片段之間各有1段20 bp左右的互補(bǔ)的序列，可以成功的獲得去掉288～309位間氨基酸片段的SopBΔ288-309基因片段。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)利用重疊延伸PCR的方法構(gòu)建了沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopB跨膜疏水片段288～309肽段缺失質(zhì)粒，并利用該質(zhì)粒與野生型SopB蛋白的功能進(jìn)行比較，研究了該疏水肽段對(duì)HeLa細(xì)胞pAkt473激活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該疏水肽段對(duì)于SopB依賴的HeLa細(xì)胞pAkt473的激活是必需的。2009年，Patel等的研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌效應(yīng)蛋白SopBΔ288-309缺失菌株感染宿主細(xì)胞后，SopBΔ288-309蛋白不能夠發(fā)生與野生型SopB類似的泛素化修飾，表明SopB跨膜結(jié)構(gòu)域288～309肽段與SopB蛋白的泛素化修飾直接相關(guān)，進(jìn)一步研究該跨膜結(jié)構(gòu)域與SopB亞細(xì)胞定位有關(guān)[9]。當(dāng)SopB缺失第288～309位肽段后，該SopB 缺失突變體能夠被分泌至宿主細(xì)胞中，而且該突變體的分泌量略低于野生型SopB蛋白。亞細(xì)胞定位研究表明，SopBΔ288-309突變體主要被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的胞漿，與野生型SopB定位于細(xì)胞膜，胞漿以及SCV完全不同[9]?；诖?/p>

推測(cè)，288～309跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域與SopB亞細(xì)胞定位至細(xì)胞

膜有關(guān)，當(dāng)突變體不能定位至細(xì)胞膜以后，SopB蛋白的泛素化也隨之消失。試驗(yàn)利用穿梭質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中表達(dá)SopBΔ288-309突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)該跨膜疏水片段與HeLa細(xì)胞pAkt473的激活直接相關(guān)。推測(cè)SopB對(duì)pAkt473磷酸化激活的功能依賴于其定位于宿主細(xì)胞膜，當(dāng)SopB不能夠亞細(xì)胞定位至細(xì)胞膜時(shí)會(huì)導(dǎo)致其激活功能的喪失。SopBΔ288-309的表型不像是由于該疏水跨膜結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致的蛋白整體構(gòu)象的變化，因?yàn)榧兓腟opBΔ288-309突變體仍然具有與野生型SopB類似的肌醇磷脂酶活性[9]，但是該實(shí)驗(yàn)也不能排除另一種可能就是該段序列的去除可能影響到SopB局部構(gòu)象的變化，例如改變了SopB與其他蛋白間的相互作用，而這些想相互作用與SopB和膜的結(jié)合有關(guān)。綜上所述，試驗(yàn)建立了一種利用重疊延伸PCR的方法構(gòu)建蛋白的缺失突變體，為蛋白質(zhì)功能的研究提供了一種可靠的手段。

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