李曄　張西軒　阮海華

摘要 [目的]研究沙門氏菌效應蛋白SopB中跨膜疏水結構域288-309肽段對受SopB誘導的HeLa細胞Akt磷酸化激活中的功能。[方法]通過重疊延伸PCR的方法構建SopB第288～309位肽段缺失突變基因，并將該基因在HeLa細胞中進行異位表達，與野生型SopB基因進行比較，確定缺失的第288～309位間肽段在受SopB誘導的Akt磷酸化激活中的作用。[結果]與空載體對照相比較，在HeLa細胞中表達野生型SopB重組質粒明顯激活了pAkt473的磷酸化，而在HeLa細胞中表達SopB缺失突變體SopBΔ288-309時，則檢測不到pAkt473的磷酸化激活。[結論]SopB表達激活HeLa細胞pAkt473的磷酸化與其第288～309位肽段的功能直接相關，該跨膜疏水結構域的缺失導致SopB蛋白不能亞細胞定位至細胞膜，從而導致SopBΔ288-309對pAkt473磷酸化激活功能的喪失。

關鍵詞 沙門氏菌屬；SopB；AKT的磷酸化

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）03-00660-03

沙門氏菌效應蛋白SopB 是由沙門氏菌SPI-1 Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的一種由561個氨基酸構成的蛋白質分子，是一種肌醇磷脂酶，是目前沙門氏菌分泌的效應蛋白中研究最多、功能最多樣化的一個蛋白[1-5]。沙門氏菌效應蛋白SopB 首先作用于質膜，激活SH3-鳥核苷酸交換因子（SGEF），間接活化交換因子RhoG，從而進一步激活肌動蛋白，誘導細胞骨架重排，促使沙門氏菌侵入宿主細胞[6]。沙門氏菌效應蛋白SopB 能夠激活原癌基因Akt473 的磷酸化，對細菌入侵介導的細胞凋亡具有抑制作用，促進宿主細胞的存活，為沙門氏菌在宿主細胞中的存活提供條件[7]。同時，SopB 通過招募RAB5 和VPS34 到SCV（Salmonella-Containing Vacuole，SCV），促進SCV在宿主細胞內的形成和成熟，這對沙門氏菌在宿主細胞內的存活與復制具有重要的意義[8]。研究表明，沙門氏菌效應蛋白SopB在感染宿主細胞后能夠發(fā)生泛素化修飾，該泛素化修飾在沙門氏菌感染宿主細胞的過程中發(fā)揮重要的作用[9-10]。利用結構預測算法（TMpred prediction algorithm）軟件分析發(fā)現(xiàn)沙門氏菌效應蛋白SopB 第288～309位氨基酸之間的肽段擁有較強的跨膜螺旋結構域。該跨膜結構域被證實與效應蛋白SopB的泛素化修飾直接相關[9]。為了深入研究該SopB跨膜結合結構域在沙門氏菌感染過程中是否與受SopB誘導的Akt的磷酸化修飾和激活有關，筆者利用重疊延伸PCR的方法構建SopB基因第288～309位肽段缺失的突變體，即SopBΔ288-309缺失突變體，并與野生型SopB蛋白的功能進行比較，以期確定該肽段與受SopB誘導的Akt的磷酸化修飾和激活之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、宿主細胞和質粒載體。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium LT2）、大腸桿菌（Ecoli）Trans 10、pCDNA4.0質粒載體、pCDNA4-SopB重組質粒和HeLa細胞，均由天津市食品生物技術重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑。質粒DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒，購自英國Omega公司；Vent DNA polymerase、限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ，均購自美國NEB公司；T4 DNA連接酶，購自美國Promega公司；細胞轉染試劑Vigofect，購自威格拉斯生物技術（北京）有限公司；引物，由上海生工生物技術有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pcDNA4-SopBΔ288-309突變體的構建。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的Salmonella Typhimurium str.LT2的SopB基因編碼序列（GenBank號為AE006468.1），利用 Primer 5.0 軟件設計2對引物（表1）。以pCDNA4-SopB重組質粒為模板，分別利用P1、P3引物對以及P2、P4引物對擴增編碼SopB 0～288蛋白的基因片段以及編碼SopB 309～561蛋白的基因片段。2個片段進行PCR反應的擴增條件均為：94 ℃，6 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30 個循環(huán)；72 ℃，10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測并分別回收純化 PCR 產(chǎn)物。最后利用P1、P2引物對，以等量的上述2種PCR產(chǎn)物為模板擴增SopBΔ288-309缺失突變體編碼基因。PCR反應條件為：94 ℃，6 min；94 ℃，30 s，58 ℃，30 s，72 ℃，2 min，30 個循環(huán)；72 ℃，10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化 PCR 產(chǎn)物。用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切并純化酶切后的片段，同時將質粒 pCDNA4.0也經(jīng)同樣雙酶切和純化。最后，將pCDNA4與SopBΔ288-309基因片段的酶切純化產(chǎn)物用 T4 連接酶體系連接，轉化 Trans 10 大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于含 Ampr的 LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑取單個菌落接種于含 Ampr的 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩過夜，酶切鑒定，獲得pCDNA4-SopBΔ288-309重組質粒，測序確認插入序列正確。

1.2.2 質粒轉染HeLa細胞。參照的方法[11-12]。

1.2.3 HeLa細胞pAKT473激活情況的檢測。參照文獻的方法[13]，收集分別轉染pCDNA4-SopB野生型質粒和pCDNA4-SopBΔ288-309突變體質粒24 h后的HeLa細胞，將細胞加等體積2×SDS載樣緩沖后，沸水浴煮沸5 min，離心1 min后進行10% SDS-PAGE電泳，轉膜，利用兔源抗pAkt473的一抗和羊抗兔二抗進行免疫印跡雜交，洗膜，最后通過ECL化學發(fā)光試劑盒進行X光片壓片，洗片。同時利用Akt抗體作為對照。

2 結果與分析

2.1 SopBΔ288-309突變基因的擴增 利用pCDNA4-SopB重組質粒作為模板，分別以P1、P3引物對和P2、P4引物對進行PCR擴增成功獲得編碼SopB 0～288蛋白序列的基因片段（圖1泳道1、2、3和4）以及SopB 309～561蛋白序列的基因片段（圖1泳道5、6、7和8）。從圖中可以看出，2種PCR片段的長度均在DNA marker的大小為750 bp的條帶附近，而且編碼SopB 0～288蛋白片段的PCR擴增產(chǎn)物的分子量（預期片段長度 864 bp）比編碼SopB 309～561蛋白片段的PCR擴增產(chǎn)物的分子量（預期片段長度 756 bp）略大一些，與預期結果相吻合。繼續(xù)以上述2種回收的PCR片段作模板，利用引物對P1、P2對其進行PCR擴增發(fā)現(xiàn)，成功擴增出了與預期的SopBΔ288-309片段長度（1 620 bp）接近的PCR產(chǎn)物（圖2）。試驗結果表明，通過重疊延伸PCR的方法即利用2種PCR片段作為模板，2個片段之間各有1段20 bp左右的互補的序列，可以成功的獲得去掉288～309位間氨基酸片段的SopBΔ288-309基因片段。

3 結論與討論

試驗利用重疊延伸PCR的方法構建了沙門氏菌效應蛋白SopB跨膜疏水片段288～309肽段缺失質粒，并利用該質粒與野生型SopB蛋白的功能進行比較，研究了該疏水肽段對HeLa細胞pAkt473激活的影響。結果發(fā)現(xiàn)，該疏水肽段對于SopB依賴的HeLa細胞pAkt473的激活是必需的。2009年，Patel等的研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌效應蛋白SopBΔ288-309缺失菌株感染宿主細胞后，SopBΔ288-309蛋白不能夠發(fā)生與野生型SopB類似的泛素化修飾，表明SopB跨膜結構域288～309肽段與SopB蛋白的泛素化修飾直接相關，進一步研究該跨膜結構域與SopB亞細胞定位有關[9]。當SopB缺失第288～309位肽段后，該SopB 缺失突變體能夠被分泌至宿主細胞中，而且該突變體的分泌量略低于野生型SopB蛋白。亞細胞定位研究表明，SopBΔ288-309突變體主要被轉運至細胞的胞漿，與野生型SopB定位于細胞膜，胞漿以及SCV完全不同[9]。基于此

推測，288～309跨膜螺旋結構域與SopB亞細胞定位至細胞

膜有關，當突變體不能定位至細胞膜以后，SopB蛋白的泛素化也隨之消失。試驗利用穿梭質粒在HeLa細胞中表達SopBΔ288-309突變體時發(fā)現(xiàn)該跨膜疏水片段與HeLa細胞pAkt473的激活直接相關。推測SopB對pAkt473磷酸化激活的功能依賴于其定位于宿主細胞膜，當SopB不能夠亞細胞定位至細胞膜時會導致其激活功能的喪失。SopBΔ288-309的表型不像是由于該疏水跨膜結構域的缺失導致的蛋白整體構象的變化，因為純化的SopBΔ288-309突變體仍然具有與野生型SopB類似的肌醇磷脂酶活性[9]，但是該實驗也不能排除另一種可能就是該段序列的去除可能影響到SopB局部構象的變化，例如改變了SopB與其他蛋白間的相互作用，而這些想相互作用與SopB和膜的結合有關。綜上所述，試驗建立了一種利用重疊延伸PCR的方法構建蛋白的缺失突變體，為蛋白質功能的研究提供了一種可靠的手段。

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