高岳

摘要

采用改良的方法提取2種土壤微生物總DNA，并采用透析法對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化，與MO BIO公司PowerSoil DNA isolation Kit試劑盒法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，改良的土壤微生物總DNA提取方法提取到的DNA明顯高于試劑盒提取的DNA，且A260/A280及A260/A230與試劑盒提取的相差不大，片段也較大，是一種經(jīng)濟(jì)方便的土壤微生物總DNA提取方法，比較適合用于構(gòu)建高質(zhì)量的宏基因組文庫(kù)。

關(guān)鍵詞 土壤微生物;透析法;DNA含量;宏基因組文庫(kù)

中圖分類號(hào) S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2014）34-12041-02

A Suitable Total Microbial DNA Extraction Method for Building Genomic Library

GAO Yue

（Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture， Suzhou， Jiangsu 215008）

Abstract Improved method was used to extract soil microbial total DNA， and the dialysis method was adopted to purify DNA. Compared with PowerSoil DNA isolation Kit of MO BIO company， the obtained DNA was analyzed. DNA per gram of soil is obviously higher than that of kit method. A260 / A280 and A260 / A230 also achieves the ideal level， the segment is larger and less impurities， indicating that it is an economic and convenient soil microbes total DNA extraction method， and is more suitable for building high quality metagenomic library.

Key words Soil microbes; Dialysis method; DNA content; Metagenomic library

微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物已經(jīng)被證明是開發(fā)新抗菌藥物的重要來(lái)源[1]。對(duì)環(huán)境樣品中未培養(yǎng)微生物的分析表明，在實(shí)驗(yàn)室中采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)微生物方法來(lái)篩選微生物代謝物可能已經(jīng)錯(cuò)過了發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)微生物自然產(chǎn)品的機(jī)會(huì)[2-3]。在大多數(shù)環(huán)境中，不能被培養(yǎng)的微生物比能進(jìn)行培養(yǎng)的微生物至少要多2～3個(gè)數(shù)量級(jí)[2-5]。同時(shí)純培養(yǎng)技術(shù)也容易得到重復(fù)的菌種，傳統(tǒng)的篩選方法得到相同代謝產(chǎn)物的幾率很高。宏基因組技術(shù)可以有效地解決上述問題，Handelman于1998年首次提出宏基因組的概念，可以通過提取環(huán)境樣品中的DNA，選擇合適的載體和宿主，將DNA轉(zhuǎn)化克隆到宿主細(xì)菌建立宏基因組文庫(kù)，進(jìn)而對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選。此方法不需要經(jīng)過純培養(yǎng)方法同樣可以對(duì)微生物的多樣性及功能進(jìn)行研究，擴(kuò)大了微生物代謝產(chǎn)物及生物活性物質(zhì)的篩選平臺(tái)。近年來(lái)，研究者已構(gòu)建了各種環(huán)境樣品的宏基因組文庫(kù)，并從中篩選到多種生物活性物質(zhì)。Brady等[6]構(gòu)建了鳳梨科植物樹莖流出液宏基因組文庫(kù)，通過異源表達(dá)，獲得具有抗菌活性的化合物palmitoylputrescine。Lim等[7]構(gòu)建了森林土壤宏基因組文庫(kù)，通過抗枯草桿菌（Bacillus subtilis）活性篩選，獲得了indirubin and indigo。Kim等[8]構(gòu)建了稻田土壤宏基因組文庫(kù)，基于功能篩選，獲得了coproporphyrin III。

DNA的提取方法主要有直接（原位）裂解法和間接（異位）裂解法2種，間接（異位）裂解法雖然能獲得大片段的DNA（20～500 kb），純度高，雜質(zhì)少，但操作繁瑣，成本高，得率低，且用此法獲得的DNA全面性差，不適用于構(gòu)建宏基因組文庫(kù)。而直接（原位）裂解法是直接對(duì)環(huán)境樣品中的微生物細(xì)胞進(jìn)行DNA提取，提出的DNA片段較?。?～50 kb），此法操作簡(jiǎn)單、成本低、得率高，且DNA更具有代表性，比較適宜構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，但用此法容易殘留樣品中的腐殖酸、棕黃酸等雜質(zhì)。

筆者通過改良的土壤微生物總DNA提取方法，提取到片段較大的DNA分子，并用透析的方法對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化，對(duì)最終的DNA用Nanodrop 2000進(jìn)行含量和純度的檢測(cè)，得到的DNA的含量和純度都達(dá)到文庫(kù)構(gòu)建的要求，為宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及后續(xù)利用文庫(kù)篩選活性物質(zhì)奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品。供試土壤樣品采集于不同地區(qū)，共2種土壤樣品。采樣時(shí)間是2014年6月，采集深度為10 cm，采集后馬上密封于塑料封口袋中，于-20 ℃下保存待用。

1.1.2 主要儀器及試劑。

PCR擴(kuò)增儀（Eppendof）;DYY6C電泳儀（北京六一儀器廠）;凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP）;Nanodrop 2000（Thermo Scientific）高速冷凍離心機(jī)（Eppendof）。

裂解緩沖液（100 mmol/L TrisHCl，100 mmol/L Na EDTA;1.5 mol/L NaCl，1%（W/V）cetyl trimethyl ammonium bromide）;10%SDS（pH8.0）;異丙醇;70%乙醇;TE（10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 改良土壤微生物總DNA提取法。

1.2.1.1 土壤DNA的提取。

樣品過篩去除雜質(zhì)，稱取125 g土樣加入150 ml裂解液，37 ℃、125 r/min離心約30 min。加入30 ml 10%SDS，70 ℃水浴2 h，每6～7 min緩慢搖勻。待樣品冷卻后4 ℃、10 ?000 r/min離心10 min，取上清液4 ℃、10 ?000 r/min離心20 min，取上清液，量體積后加入0.7倍體積的異丙醇，輕輕混勻室溫放置30 min后4 ℃、10 ?000 r/min離心30 min。棄上清液（完全去除液體），加入100 ml 70%乙醇，4 ℃、10 ?000 r/min離心10 min，棄上清液，自然晾干，使樣品完全沒有乙醇味（可能需要放置過夜）。用5 ml TE重懸浮DNA（必要時(shí)可適當(dāng)多加TE），輕輕翻動(dòng)離心瓶，使DNA完全溶解，可在50 ℃下加熱20～30 min，以加快溶解。

1.2.1.2 土壤DNA的純化及濃縮。

制一塊1%的瓊脂糖凝膠，膠孔需能容納1.0～1.5 ml DNA粗體液，將粗提液預(yù)熱至50 ℃后，全部加入膠孔中，135 V電壓下1 h后，將電壓降至60 V 4～5 h，用0.5×TBE buffer清洗膠孔后，換掉膠槽中原有的TBE。將電壓降至35 V過夜（約10 h），將膠兩邊各切下2.5 cm寬（其中1 cm寬含DNA），用EB染色30 min，在紫外燈下確定DNA條帶位置，在原大膠上相應(yīng)位置切下1 cm寬，包含DNA的膠條。將膠條放入透析袋中，加入10 ml的0.5×TBE，排除氣泡，100 V下3 h，再30～40 V反向1 min。將透析袋中的TBE轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中，再用5 ml的TBE洗一遍透析袋后，轉(zhuǎn)移到同一離心管中，5 400 r/min下離心20 min。將上清液轉(zhuǎn)移到50 ml離心濃縮管中，5 400 r/min下離心10 min，多次離心使最后體積降至1 ml以下。在樣品中加入15 ml TE，5 400 r/min下離心10 min，多次離心使體積降至250～500 μl，重復(fù)此步驟2～3次。用切口槍頭輕柔地沖洗濃縮管膜幾次，轉(zhuǎn)移濃縮DNA至滅菌1.5 ml離心管中，再用500 μl TE沖洗濃縮管膜后，轉(zhuǎn)移到另一1.5 ml離心管中。

1.2.2 PowerSoil DNA isolation Kit試劑盒法。

參照試劑盒相關(guān)說明書進(jìn)行提取。

1.3 土壤DNA的含量及純度檢測(cè)

采用Thermo Scientific公司的Spectrophotometer Nanodrop 2000測(cè)定DNA含量，并測(cè)定A260/A280、A260/A230的比值以確定提取DNA的純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤總DNA電泳結(jié)果

為了更好地為后續(xù)宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建服務(wù)，土壤總DNA的大小應(yīng)在23 kb以上。從圖1可以看出，2個(gè)樣品、2種提取方法的DNA大小都在23 kb以上，符合建庫(kù)要求，但改良法提取的DNA條帶明顯比試劑盒的條帶亮，說明提取的DNA含量較高;2種方法提取的DNA條帶都較均勻且均無(wú)明顯雜帶，說明2種方法提取到的DNA相對(duì)較純，且無(wú)明顯雜質(zhì)。

注：1、3為改良法提取的DNA，2、4為試劑盒法提取的DNA。M=λHind Ⅲ。

圖1 2種方法所獲得的土壤總DNA的凝膠電泳分析

2.2 土壤總DNA的得率和純度

從表1可以看出，改良提取法的DNA獲得率較高，提取的DNA濃度均在70 μg以上/g土壤，而用試劑盒法提取的DNA濃度在40 μg左右/g土壤。

表1 2種方法提取2種土壤樣品的DNA得率

μg/g

土壤樣品DNA含量

改良法試劑盒法

175.65±0.5436.37±0.45

273.12±0.3533.17±0.19

平均74.38534.77

在土壤樣品提取過程中，一些雜蛋白、腐殖酸和酚類等物質(zhì)往往會(huì)殘留在DNA中而影響后期的文庫(kù)構(gòu)建等。通常檢測(cè)DNA樣品純度的指標(biāo)有A260/A280和A260/A230，前者主要用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的殘留情況，比值在1.8～2.0較理想;后者用來(lái)檢測(cè)糖類、鹽類等有機(jī)物殘留情 況，比值在2.0～2.5較理想。從表2可以看出，2種提取方法提取的DNA純度都較高，A260/A280都達(dá)到了1.6以上，而A260/A230也達(dá)到了1.7以上，比較接近理想水平。

表2 2種方法提取2種土壤樣品的DNA純度分析

方法A260/A280樣品1樣品2A260/A230樣品1樣品2

改良法1.64±0.171.61±0.071.75±0.121.73±0.11

試劑盒法1.68±0.091.66±0.051.81±0.041.78±0.06

3 結(jié)論

在基因組文庫(kù)構(gòu)建過程中，土壤DNA的片段大小以及DNA的純度，都直接影響文庫(kù)的質(zhì)量，并影響后續(xù)文庫(kù)的篩選。該研究采用改進(jìn)的土壤總DNA提取法，提取的土壤DNA得率高，且相同重量的土壤，提取到的DNA量大，從而在一定程度上減少了非優(yōu)勢(shì)菌種的損失;同時(shí)改良法獲得的DNA在片段大小以及純度上也基本達(dá)到了理想水平。且采用改良法提取土壤DNA在同等條件下所需的費(fèi)用比試劑盒法低很多，能節(jié)約大量的研究經(jīng)費(fèi)。綜合各方面因素，該研究所使用的改良法是一種經(jīng)濟(jì)、高效的提取土壤總DNA的方法，提取的DNA能很好地用于構(gòu)建高質(zhì)量的宏基因組文庫(kù)。

參考文獻(xiàn)

[1] NEWMAN D J，CRAGG G M.Natural products as sources of new drugs over the last 25 years[J].J Nat Prod，2007，70：461-477.

[2] HUGENHOLTZ P，GOEBEL B M，PACE N R.Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity[J].J Bacteriol，1998，180：4765-4774.

[3] RAPPE M S，GIOVANNONI S J.The uncultured microbial majority[J].Annu Rev Microbiol，2003，57：369-394.

[4] TORSVIK V，GOKSOYR J，DAAE F L.High diversity in DNA of soil bacteria[J].Appl Environ Microbiol，1990，56：782-787.

[5] TORSVIK V，DAAE F L，SANDAA R A，et al.Novel techniques for analysing microbial diversity in natural and perturbed environments[J].J Biotechnol，1998，64：53-62.

[6] BRADY S F，CLARDY J.Palmitoylputrescine，an antibiotic isolated from the heterologous expression of DNA extracted from bromeliad tank water[J].J Nat Prod，2004，67（8）：1283-1286.

[7] LIM H K，CHUNG E J，KIM J C，et al.Characterization of a forest soil metagenome clone that confers indirubin and indigo production on Escherichia coli[J].Appl Environ Microbiol，2005，71（12）：7768-7777.

[8] KIM J S，LIM H K，LEE M H，et al.Production of porphyrin intermediates in Escherichia coli carrying soil metagenomic genes[J].FEMS Microbiol Lett，2009，295（1）：42-49.