黃磊，許文，盧祥嬋，鄧建寧，陳威巍，聶為民，秦恩強，趙敏，周先志

·論著·

HIV感染者外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)與膠原沉積的關系研究

黃磊，許文，盧祥嬋，鄧建寧，陳威巍，聶為民，秦恩強，趙敏，周先志

目的通過對不同感染階段HIV感染者外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞、膠原蛋白、白細胞介素（interleukin, IL）-7的檢測，以及CD4+T淋巴細胞計數(shù)與膠原沉積的相關性分析，探討HIV感染后膠原沉積對CD4+T淋巴細胞的影響。方法選擇HIV感染者43例，分為HIV感染無癥狀組和AIDS組，留取外周淺表淋巴結活體組織檢查（活檢）組織；另外選擇非HIV感染者12名為健康對照組，同樣留取其外周淺表淋巴結活檢組織。利用免疫組織化學方法檢測研究對象淋巴結中CD4+T淋巴細胞、Ⅰ型膠原蛋白和IL-7定量及分布情況。結果①隨著病程進展，HIV感染者外周淺表淋巴結中膠原沉積逐漸增加，AIDS組高于無癥狀組，無癥狀組高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；②HIV感染無癥狀組外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而AIDS組則顯著減少（P＜0.01）；③HIV感染者外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)與膠原沉積量呈負相關（R2=0.724，P=0.000），與外周血中CD4+T淋巴細胞計數(shù)呈正相關（R2=0.702，P=0.000）；④3組IL-7的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而AIDS組部分患者淋巴結中IL-7呈局部聚集性分泌。結論HIV感染后外周淺表淋巴結中膠原沉積逐漸增加導致結構破壞，可能是CD4+T淋巴細胞進行性減少的一個重要原因，雖然IL-7有隨病程進展而分泌增加的趨勢，但仍不足以彌補淋巴結結構破壞對CD4+T淋巴細胞的影響。

HIV；獲得性免疫缺陷綜合征；膠原蛋白；CD4+T淋巴細胞；白細胞介素-7

CD4+T淋巴細胞的減少是HIV致病的中心環(huán)節(jié)和病程進展的重要標志[1-2]。HIV通過多種機制導致感染者CD4+T淋巴細胞減少，例如：HIV對CD4+T淋巴細胞的直接殺傷作用；HIV感染后因免疫系統(tǒng)損傷導致的廣泛免疫激活；HIV感染導致胸腺功能受抑，致使CD4+T淋巴細胞生成不足。淋巴結是CD4+T淋巴細胞定居的主要部位之一，也是HIV感染重要場所，HIV在淋巴結中反復感染，導致淋巴結內(nèi)持續(xù)炎癥狀態(tài)，進而引起其結構破壞。由于淋巴結是淋巴細胞發(fā)育、分化、成熟的重要免疫器官，其正常結構對于維持CD4+T淋巴細胞的正常循環(huán)、生存及功能至關重要[3]。本研究擬通過對HIV感染者外周淺表淋巴結中膠原蛋白沉積、CD4+T淋巴細胞計數(shù)及白細胞介素（interleukin,IL）-7分泌的觀察，探討HIV感染后淋巴結結構改變對CD4+T淋巴細胞的影響，以期為AIDS發(fā)病機制的研究提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象選取2009—2013年在解放軍第三〇二醫(yī)院和南寧市第四人民醫(yī)院就診且有外周淺表淋巴結腫大的HIV感染者43例，年齡26～58（40.17± 10.23）歲。其中30例因異性不潔性行為感染，6例因同性不潔性行為感染，5例因不潔靜脈注射感染，2例感染途徑不詳?；颊吆炗喼橥鈺?，常規(guī)手術留取外周淺表淋巴結活體組織檢查（活檢）組織（頸部24例，腋窩17例，腹股溝2例）。根據(jù)《艾滋病診療指南（2011版）》[4]，將感染者分為HIV感染無癥狀組（11例）和AIDS組（32例）。其中，24例在手術當天留取外周血檢測CD4+T淋巴細胞計數(shù)。另外選擇12名非HIV感染者為健康對照組，留取其外周淺表淋巴結活檢組織，病理診斷均為反應性增生。

1.2 主要儀器和試劑采用美國BD公司（FACS Calibur型）流式細胞儀對HIV感染者全血樣本CD4+T淋巴細胞計數(shù)進行測定。流式CD3/CD4/ CD8抗體購自美國BD公司，免疫組化鼠抗人Ⅰ型膠原蛋白單克隆抗體、鼠抗人CD4單克隆抗體和兔抗人IL-7單克隆抗體均購自英國Abcam公司。

1.3 全血CD4+T淋巴細胞計數(shù)測定取50μl抗凝血加入絕對計數(shù)管（TruCOUNT Tubes）中，加入10μlCD3/CD4/CD8抗體，室溫避光染色20min。加入10倍稀釋的溶血素（FACSLysing Solution）450μl，混勻避光15min，上機檢測。

1.4 免疫組織化學采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法（SP法）。手術摘取淋巴結后，以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，切片常規(guī)脫蠟至水。CD4、IL-7抗體染色切片，置入pH值8.0 EDTA溶液中，微波抗原修復；Ⅰ型膠原蛋白抗體染色切片，以胰蛋白酶消化。隨后0.3%～3.0% H2O2-甲醇溶液去除內(nèi)源過氧化物酶，血清封閉后分別加入相應抗體，4℃過夜，加相應二抗孵育，以AEC顯色，陽性為紅色。以HIV感染者淋巴結加PBS替代抗體組和非HIV感染者淋巴結加抗體組作為陰性對照。

1.5 圖像分析在20倍光學顯微鏡下觀察。CD4抗體染色每張切片任取10個視野，對每個視野內(nèi)淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)，取平均值。利用LEICA Qwin圖像分析系統(tǒng)對膠原蛋白或IL-7抗體染色的每張切片任意10個視野進行灰度分析，檢測膠原蛋白和IL-7在淋巴結中表達的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理用CHISS 2004軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。定量資料呈正態(tài)分布，用±s表示，指標在3組間比較用單因素方差分析（組間數(shù)據(jù)方差齊），兩兩比較用q檢驗。HIV感染者外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)與外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)的相關性分析用pearson相關分析和直線回歸分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

表1 3組外周淺表淋巴結中膠原蛋白沉積量比較（±s，灰度)Table 1 Com parison of collagen deposition in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups（±s,grey scale)

表1 3組外周淺表淋巴結中膠原蛋白沉積量比較（±s，灰度)Table 1 Com parison of collagen deposition in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups（±s,grey scale)

注：兩兩比較，AIDS組vs無癥狀組，P=0.000；AIDS組vs健康對照組，P=0.000；無癥狀組vs健康對照組，P=0.035

項目n膠原蛋白AIDS組3260.293±9.982無癥狀組1135.886±15.708健康對照組1224.303±8.139 F值54.515 P值0.000

圖1 HIV感染者外周淺表淋巴結中Ⅰ型膠原蛋白沉積情況Figure 1 TypeⅠcollagen deposition in peripheral superficial lym ph nodes of HIV-infected individuals

2.1 HIV感染者外周淺表淋巴結中膠原蛋白沉積情況HIV感染后，外周淺表淋巴結中Ⅰ型膠原蛋白沉積逐漸增加。AIDS組高于無癥狀組，無癥狀組高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1、圖1）。病理評估顯示，在無癥狀組中，6例淋巴結內(nèi)可見增生淋巴濾泡，2例未見淋巴濾泡；而AIDS組中則很難看到淋巴濾泡，在所有32例中僅7例可見到萎縮淋巴濾泡，部分患者淋巴細胞極度減少，代之以大量的沉積膠原。

2.2 HIV感染者外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)與健康對照組相比，無癥狀組外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而AIDS組顯著減少（P＜0.01）。AIDS組較無癥狀組亦顯著減少（P＜0.01）（表2、圖2）。

表2 3組外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)比較（±s，個/200倍視野)Table 2 Comparison of CD4+T lymphocyte count in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups (±s,cells/200 times visual field)

表2 3組外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)比較（±s，個/200倍視野)Table 2 Comparison of CD4+T lymphocyte count in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups (±s,cells/200 times visual field)

注：兩兩比較，AIDS組vs無癥狀組，P=0.000；AIDS組vs健康對照組，P=0.000；無癥狀組vs健康對照組，P=0.200

項目nCD4+T淋巴細胞計數(shù)AIDS組3267.604±42.273無癥狀組11198.727±76.334健康對照組12234.232±51.029 F值57.072 P值0.000

圖2 HIV感染者外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞Figure 2 CD4+T cells in peripheral superficial lymph nodes of HIV-infected individuals

2.3 HIV感染者外周淺表淋巴結CD4+T淋巴細胞計數(shù)與膠原沉積及外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)相關性

2.3.1 HIV感染者外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)與膠原沉積的相關性43例HIV感染者外周淺表淋巴結內(nèi)Ⅰ型膠原沉積量與CD4+T淋巴細胞計數(shù)呈負相關（R2=0.724，P=0.000）。直線回歸方程為：外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)=237.408-2.283×Ⅰ型膠原沉積量（圖3）。

2.3.2 HIV感染者外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)與外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)的相關性24例HIV感染者在行淋巴結活檢當天留取外周血，分析顯示外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)與淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)呈正相關（R2=0.702，P=0.000）。直線回歸方程為：外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)=2.056×外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)（個/mm3）－57.712（圖4）。

圖3 HIV感染者外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)與Ⅰ型膠原蛋白沉積量的相關性Figure 3 Correlation between CD4+T lym phocyte count and typeⅠcollagen deposition in peripheral superficial lymph nodes of HIV-infected individuals

圖4 HIV感染者外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)與外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)的相關性Figure 4 Correlation between CD4+T lym phocyte count in peripheral blood and that in peripheral superficial lymph nodes of HIV-infected individuals

表3 3組外周淺表淋巴結中IL-7水平比較（±s，灰度）Table 3 Comparison of IL-7 level in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups(±s,grey scale)

表3 3組外周淺表淋巴結中IL-7水平比較（±s，灰度）Table 3 Comparison of IL-7 level in peripheral superficial lym ph nodes among the three groups(±s,grey scale)

注：兩兩比較，AIDS組vs無癥狀組，P=0.126；AIDS組vs健康對照組，P=0.677；無癥狀組vs健康對照組，P=0.124

項目nIL-7 AIDS組32120.711±64.527無癥狀組11112.275±24.714健康對照組1289.424±40.861 F值1.447 P值0.245

2.4 HIV感染者外周淺表淋巴結中IL-7定量和分布健康對照組、無癥狀組和AIDS組外周淺表淋巴結中IL-7的分泌水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。而AIDS組部分患者淋巴結內(nèi)IL-7呈局部聚集性表達（圖5）。

圖5 HIV感染者外周淺表淋巴結中IL-7的定量及分布圖Figure 5 Quantitation and distribution of IL-7 in peri-pheralsuperficial lymph nodes of HIV-infected individuals

3 討論

維持CD4+T淋巴細胞的相對正常數(shù)量以及功能，始終是HIV/AIDS治療的焦點和核心。HIV感染后CD4+T淋巴細胞數(shù)量經(jīng)歷了一個動態(tài)變化的過程。在急性感染期，HIV大量復制，導致外周血CD4+T淋巴細胞迅速減少。急性期后，由于病毒特異性免疫的出現(xiàn)，病毒復制下降，外周血CD4+T淋巴細胞數(shù)量逐漸恢復至亞正常狀態(tài)，繼之進入一個漫長的緩慢下降過程，直至AIDS期。

HIV感染后機體CD4+T淋巴細胞數(shù)量的維持至少由4方面因素決定：①HIV感染直接或間接作用導致CD4+T淋巴細胞的消耗；②胸腺等中樞免疫器官CD4+T淋巴細胞的再生能力；③外周免疫器官對CD4+T淋巴細胞正常生存和發(fā)育的維持；④CD4+T淋巴細胞在血液及淋巴中的正常循環(huán)[5-6]。淋巴結作為重要的外周免疫器官，是淋巴細胞發(fā)生免疫應答的主要場所之一，對維持CD4+T淋巴細胞的生存、發(fā)育和循環(huán)發(fā)揮著關鍵作用[3，5-6]。而正常結構是淋巴結以上功能的基本保障，這是因為淋巴結的正常結構為CD4+T淋巴細胞的循環(huán)、發(fā)育和分化提供了支架及免疫微環(huán)境，保證CD4+T淋巴細胞能與樹突細胞（dendritic cells,DCs）接觸，并產(chǎn)生正確的免疫應答；作為淋巴結內(nèi)T淋巴細胞區(qū)的基本骨架，成纖維網(wǎng)狀細胞（fibroblastic reticular cells,FRCs）是體內(nèi)IL-7的主要來源，而IL-7在維持T淋巴細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關鍵作用[6-9]。

淋巴結中包含了機體70%的CD4+T淋巴細胞，是HIV感染的主要部位[9]。為了闡述HIV感染對淋巴結結構的影響，我們分析了HIV感染后Ⅰ型膠原蛋白在淋巴結中的沉積情況。結果表明隨著病程的進展，HIV感染者外周淺表淋巴結中Ⅰ型膠原蛋白沉積逐漸增加，同時出現(xiàn)結構改變，最終導致淋巴濾泡萎縮乃至消失。前期有研究顯示，HIV-1感染者淋巴結中膠原蛋白的沉積隨著病程的進展而遞增，導致副皮質(zhì)區(qū)T淋巴細胞區(qū)結構破壞，其沉積的范圍與淋巴組織中CD4+T淋巴細胞計數(shù)及抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療后外周血CD4+T淋巴細胞的變化呈負相關[10-13]。我們的研究也顯示，雖然無癥狀組與健康對照組外周淺表淋巴結中的CD4+T淋巴細胞計數(shù)無顯著差異，但AIDS組顯著減少，且HIV感染者外周淺表淋巴結中CD4+T淋巴細胞計數(shù)與膠原沉積量呈負相關，與外周血CD4+T淋巴細胞計數(shù)呈正相關。一些晚期AIDS患者的淋巴結中CD4+T淋巴細胞幾乎難以覓及，代之以大量膠原沉積。

IL-7對于初始T淋巴細胞的存活是必不可少的。IL-7缺乏可使外周T淋巴細胞逐漸減少，反之則可使外周初始T細胞群擴大[14]。淋巴結內(nèi)T細胞區(qū)的FRCs是體內(nèi)IL-7的主要來源之一[7-8]。為了進一步明確淋巴結結構破壞對CD4+T淋巴細胞的影響，我們分析了IL-7在HIV感染者外周淺表淋巴結中的定量及分布情況。結果顯示，雖健康對照組、無癥狀組和AIDS組IL-7表達逐漸升高，但3組外周淺表淋巴結中IL-7的定量差異無統(tǒng)計學意義，而AIDS組部分患者淋巴結內(nèi)IL-7呈局部聚集性表達。這提示，為了代償CD4+T淋巴細胞的減少，淋巴結中IL-7的分泌有所增加，但仍不足以彌補疾病對CD4+T淋巴細胞的消耗，特別是由于淋巴結結構紊亂，IL-7聚集性分布，不能保證所有CD4+T淋巴細胞都能與IL-7充分接觸，故仍難以維持其正常生存。

HIV感染后由于淋巴結結構的破壞，導致CD4+T淋巴細胞賴以生存的免疫微環(huán)境受損，使CD4+T淋巴細胞生存能力下降，并可能影響了其與DCs細胞的接觸，不能產(chǎn)生正確的免疫應答；同時，由于膠原蛋白對淋巴細胞有粘附作用，膠原大量沉積，可能增加了對淋巴細胞的粘附能力，并影響淋巴結中淋巴細胞流入及流出道，進而影響CD4+T淋巴細胞的循環(huán)[15-17]。總之，HIV感染后外周淺表淋巴結中膠原沉積逐漸增加導致結構破壞，可能是CD4+T淋巴細胞進行性減少的一個重要原因，雖然IL-7有隨病程進展而分泌增加的趨勢，但仍不足以彌補淋巴結結構破壞對CD4+T淋巴細胞的影響。

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（2014-06-23收稿 2014-08-12修回）

（責任編委 王永怡 本文編輯 張云輝）

Correlation between CD4+T lym phocyte count in peripheral superficial lym ph nodes and collagen deposition in HIV-infected individuals

HUANG Lei,XUWen，LU Xiang-chan,DENG Jian-ning,
CHENWei-wei,NIEWei-min,QIN En-qiang,ZHAO Min*,ZHOU Xian-zhi*Treatment and Research Center for Infectious Diseases,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China
*Corresponding author,Zhao Min,E-mail:drzhaomin@sina.com;ZHOU Xian-zhi,E-mail:zxz.302@163.com

Objective To investigate the effects of collagen deposition on CD4+T lymphocyte count in peripheral superficial lymph nodesofHIV-infected individualsby detecting CD4+T lymphocyte count,collagen and interleukin(IL)-7 and analyze the correlation between CD4+T lymphocyte count and collagen deposition.M ethods Forty-three HIV-infected individualswere divided into asymptomatic HIV carriers(asymptomatic group)and AIDSpatients(AIDSgroup).Twelve subjectswithoutHIV infection were recruited as a control group.Peripheral superficial lymph nodes of all the groupswere obtained.Immunohistochemistry was used to detect expression and distribution of CD4+T lymphocytes,typeⅠcollagen and IL-7 in peripheral superficial lymph nodes.Results With disease progression,collagen deposition in peripheral superficial lymph nodes of HIV-infected individuals increased gradually.Collagen deposition in AIDSgroup was higher than that in asymptomatic group,which was higher than that in the control group,and differences between the three groupswere significant(P＜0.05).CD4+T lymphocyte counts in peripheralsuperficial lymph nodeswere notsignificantly differentbetween the asymptomatic group and the control group(P＞0.05),while thatof AIDSpatients decreased significantly(P＜0.01). CD4+T lymphocyte count in peripheralsuperficial lymph nodesofHIV-infected individualshad a strong negative linear correlationwith collagen deposition(R2=0.724,P=0.000),and a strong positive linear correlation with CD4+T lymphocyte count in peripheral blood (R2=0.702,P=0.000).Expressions of IL-7 in peripheral superficial lymph nodes were not significantly different among the three groups(P＞0.05),butpresented with localaggregation in some AIDSpatients.Conclusions Gradually increasing collagen deposition destroys the structure of peripheral superficial lymph nodes after HIV infection,whichmay be one of the important reasons for CD4+T lymphocyte depletion in lymph nodes.Although the expression of IL-7 has a rising tendency in lymph nodes of HIV-infected individualswith disease progression,destruction of lymph nodes structure remains a uncompensatory effecton CD4+T lymphocytes.

HIV;acquired immunodeficiency syndrome;collagen;CD4+T cells;interleukin-7

R512.91

A

1007-8134(2014)06-0337-05

國家自然科學基金項目（30771897、81072423）；全軍醫(yī)學科技“十二五”科研面上項目（CWS11J160）；南寧市科學研究與技術開發(fā)計劃、創(chuàng)新計劃項目科研課題（201003047C-1）

100039北京，解放軍第三○二醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心（黃磊、許文、陳威巍、聶為民、秦恩強、趙敏、周先志）；530023，南寧市第四人民醫(yī)院/廣西艾滋病臨床治療中心艾滋病科（盧祥嬋、鄧建寧）

周先志，E-mail:zxz302@163.com；趙敏，E-mail:drzhaomin @sina.com