張巖巖,黃 寧,田京京,馮玉康,孫勝斌,姜國志

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司, 河北 石家莊 051430；2.河北省中藥注射劑工程技術(shù)中心，河北 石家莊 051430)

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超濾在燈盞花素注射液中的應(yīng)用研究

張巖巖1,2,黃 寧1,田京京1,馮玉康1,孫勝斌1,2,姜國志1,2

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司, 河北 石家莊 051430；2.河北省中藥注射劑工程技術(shù)中心，河北 石家莊 051430)

目的：考察4種不同規(guī)格的超濾膜對燈盞花素注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素和化學(xué)成分的影響，選擇適合生產(chǎn)使用的超濾膜。方法：分別選取10KD聚醚砜、10KD纖維素、30KD聚醚砜、30KD纖維素超濾膜對燈盞花素注射液進(jìn)行超濾，測定不同超濾過程前后細(xì)菌內(nèi)毒素、含量、有關(guān)物質(zhì)以及膜通量變化，篩選適宜燈盞花素注射液使用的超濾膜。結(jié)果：不同截留相對分子質(zhì)量的超濾膜對燈盞花素注射液的過濾效果存在差異：10KD超濾膜對藥液燈盞花素含量及有關(guān)物質(zhì)截留率較高，相應(yīng)的水通量恢復(fù)率較低；聚醚砜超濾膜膜通量大于纖維素超濾膜，過濾時間短。結(jié)論：10KD聚醚砜超濾膜能有效去除細(xì)菌內(nèi)毒素，保留有效成分并去除雜質(zhì)分子，同時能保證較高的膜通量，適用于燈盞花素注射液的生產(chǎn)。

燈盞花素注射劑； 超濾膜； 細(xì)菌內(nèi)毒素；含量測定

燈盞花素注射液是從燈盞細(xì)辛中提取分離得到的燈盞花素而制得的中藥注射劑。燈盞花素注射液具有保護(hù)心臟、腎組織、糖尿病性肝臟，活血化瘀、抗血栓形成、心律失常，減少腦組織缺血及再灌注損害，改善糖尿病腎病血液流變學(xué)，通絡(luò)止痛的功效[1-2]，被廣泛應(yīng)用于中風(fēng)及其后遺癥、冠心病、心絞痛等的治療[3]。

本文主要通過對燈盞花素注射液超濾前后的細(xì)菌內(nèi)毒素、含量、有關(guān)物質(zhì)以及膜通量的變化綜合考慮超濾對燈盞花素的質(zhì)量影響。對細(xì)菌內(nèi)毒素的控制作為中藥注射劑一項(xiàng)安全性指標(biāo)至關(guān)重要。注射劑中的熱原主要是細(xì)菌內(nèi)毒素，為革蘭陰性菌外壁層的脂多糖物質(zhì)，此類物質(zhì)具有耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性，不易被除滅。傳統(tǒng)的熱原去除法是活性炭吸附法，但因部分有效成分也被吸附，而使其適用性受到限制[4]。并且由于操作復(fù)雜，影響因素較多，重現(xiàn)性不好。近年來，超濾技術(shù)的應(yīng)用日趨成熟，由于其無相變、能耗低、操作簡便、對環(huán)境無污染的特點(diǎn)，在醫(yī)藥行業(yè)逐步得到應(yīng)用推廣。

本實(shí)驗(yàn)采用不同材質(zhì)、不同截留分子量的超濾膜，對燈盞花素注射液過濾效果進(jìn)行考察，選出適宜用燈盞花素注射液生產(chǎn)使用的超濾膜[5]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilen 1260 高效液相色譜儀；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)；Millipore 蠕動泵；10KD聚醚砜超濾膜、30KD聚醚砜超濾膜、10KD纖維素超濾膜、30KD纖維素超濾膜(密理博(上海)貿(mào)易有限公司提供)。

1.2 材料

燈盞花素注射液藥液(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號1303011)，燈盞花乙素對照品(批號110842-201106，中國食品藥品生物制品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純；水為注射用水。

2 方法

2.1 樣品制備

取燈盞花素注射液中間體，加注射用水稀釋，制成與實(shí)際生產(chǎn)藥液相當(dāng)?shù)臉悠贰?/p>

2.2 超濾試驗(yàn)

取燈盞花素溶液適量，平均分成4份，分別選擇10 KD聚醚砜超濾膜、10KD纖維素超濾膜、30 KD聚醚砜超濾膜、30KD纖維素超濾膜過濾。藥液溫度30℃，操作壓力0.06MPa，泵轉(zhuǎn)速180r/min。藥液經(jīng)超濾膜過濾后進(jìn)行循環(huán)，待藥液平衡后，收集濾過液。藥液快過濾完時，加補(bǔ)入適量注射用水。超濾結(jié)束后，收集濾過液，并記錄其體積。

2.3 樣品指標(biāo)成分測定

2.3.1 動態(tài)濁度法測定細(xì)菌內(nèi)毒素 依照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[6]進(jìn)行動態(tài)濁度法測定細(xì)菌內(nèi)毒素。通過燈盞花素注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果，樣品在稀釋20倍后得到很好的回收率，故此次測定取40倍的稀釋液即可。

2.3.2 燈盞花素含量測定 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸溶液(40：60)為流動相；流速為1.0mL/min；柱溫40℃；檢測波長為335nm。理論塔板數(shù)按燈盞乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000[7]。

(1)對照品溶液制備。 取燈盞乙素對照品10mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇70mL，超聲處理(功率300W，頻率50kHz)45min，取出，放置室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

(2)供試品溶液制備 。取本品5mL，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

(3)測定法。 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3.3 有關(guān)物質(zhì)[8]色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Zorbax SB-C18，4.6×250mm，5μm；流動相：A:0.5%甲酸，B乙腈，C甲醇。梯度洗脫。流速：1mL/min；檢測波長：335nm；柱溫：30℃。理論塔板數(shù)按燈盞花乙素計(jì)算應(yīng)不低于30 000。

(1)對照溶液制備。精密稱取105℃干燥至恒重的燈盞花乙素對照品適量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得。

(2)供試品溶液的制備。精密吸取供試品溶液適量，加水稀釋成每1mL含燈盞花乙素0.2mg的溶液，搖勻，通過0.45μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

(3)測定法。精密吸取對照溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

將本品圖譜縱坐標(biāo)調(diào)整為燈盞乙素峰峰高的10%,此條件下能檢出的色譜峰均要求積分(溶劑峰不積分)，計(jì)算燈盞花乙素峰以外的雜質(zhì)峰總面積占總峰面積的比例。

表1 梯度洗脫

2.4 超濾過程膜通量的測定

超濾前，用注射用水清洗膜至pH值為中性，測定膜純水通量；超濾過程中分別測定超濾開始、超濾液體積為原液總體積1/2 時及超濾結(jié)束前的膜通量，計(jì)算超濾過程平均膜通量。超濾結(jié)束后，先用注射用水循環(huán)洗去殘存料液，再用0.1mol/L NaOH循環(huán)30min后，最后用注射用水清洗膜至中性，測定膜純水通量恢復(fù)率[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品指標(biāo)性成分變化

表2 4種不同超濾膜超濾前后燈盞花素注射液指標(biāo)性成分變化結(jié)果

3.2 不同超濾膜對燈盞花素注射液的影響

結(jié)果表明不同規(guī)格的超濾膜過濾后，燈盞花素注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素、燈盞花素含量、相關(guān)物質(zhì)均有不同程度降低。超濾后細(xì)菌內(nèi)毒素值降低率為96.8%～99.2%，根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，完全符合注射劑內(nèi)毒素的要求。燈盞花素含量的降低率為1.5%～5.6%，而有關(guān)物質(zhì)的降低為46%～73%，綜合比較有關(guān)物質(zhì)降低率與燈盞花素含量降低率，發(fā)現(xiàn)有關(guān)物質(zhì)降低率大于燈盞花素含量降低率，即四種超濾均可在保留燈盞花素的同時除去雜質(zhì)。不同材質(zhì)超濾膜截留效果不同，聚醚砜對燈盞花素注射液的截留效果稍好于纖維素超濾膜。超濾膜孔徑對截留效果影響較大，10KD超濾膜對細(xì)菌內(nèi)毒素及有關(guān)物質(zhì)的截留率明顯大于30KD超濾膜。

3.3 超濾膜膜通量變化

表3 樣品對4種超濾膜通量的變化情況 (mL/min)

3.4 燈盞花素注射液對不同超濾膜的影響

不同規(guī)格超濾膜清洗后膜通量恢復(fù)率為75%～90%，大于75%，即燈盞花素注射液對超濾膜污染低，清洗后可繼續(xù)使用。對比膜通量數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，聚醚砜超濾膜超濾過程中平均膜通量大于纖維素超濾膜，且膜通量恢復(fù)率也高于纖維素膜，30KD超濾膜膜通量及膜通量恢復(fù)率明顯大于10KD超濾膜，所以生產(chǎn)過程使用聚醚砜材質(zhì)過濾時間短于纖維素材質(zhì)，30KD截留分子量過濾時間短于10KD截留分子量超濾膜。

4 結(jié)論

超濾膜可有效去除燈盞花素注射液細(xì)菌內(nèi)毒素，并且能在保留有效成分的同時去除雜質(zhì)。不同材質(zhì)超濾膜對燈盞花素注射液效果差異不大，不同截留分子量效果差異較大。10KD膜包對燈盞花素注射液截留效果優(yōu)于30KD超濾膜，聚醚砜材質(zhì)過濾時間短于纖維素材質(zhì)，故10KD聚醚砜材質(zhì)超濾膜更適合燈盞花素注射液生產(chǎn)使用。

5 討論

超濾膜截留分子量小的，對細(xì)菌內(nèi)毒素及有關(guān)物質(zhì)截留率高，但膜通量較低，造成過濾時間延長，影響生產(chǎn)效率，同時增加藥液污染的風(fēng)險。超濾應(yīng)用于燈盞花素注射液生產(chǎn)中應(yīng)綜合評估截留效果與生產(chǎn)時間的風(fēng)險與收益，并采取相應(yīng)措施保證產(chǎn)品質(zhì)量。

超濾應(yīng)用于生產(chǎn)還應(yīng)進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化，一方面選擇合適的藥液濃度，減少或避免濃度極化現(xiàn)象；另一方面通過細(xì)化超濾操作壓力、泵轉(zhuǎn)速等參數(shù)，確保較大的膜通量，提高生產(chǎn)效率，降低污染風(fēng)險，滿足生產(chǎn)需要。

[1] 楊淑艷，鐘秀宏，張以忠，等．燈盞花素藥理作用研究進(jìn)展[J]．吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2008，29(6)：360-363．

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[3] 張曉丹，劉婧，張衛(wèi)兵，等．燈盞花素心血管藥理及臨床研究進(jìn)展[J]．中國藥業(yè)，2007，21(16)：3-5．

[4] 尹楠,李紅陽,彭國平,等. 超濾法去除中藥注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2008(12):927-929.

[5] 孫晶波,姜國志,劉鑫. 超濾在冠心寧注射液工藝中的應(yīng)用及對有效成分的影響 [J]. 河北化工,2011(7):18-21.

[6] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄VIII D.

[7] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：378-380.

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[9] 韓麗. 應(yīng)用逆流提取與膜分離技術(shù)的中藥注射劑新工藝研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué),2003.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Applicationon Dengzhanhuasu Injectionin the Process of Ultrafiltration

Zhang Yanyan1,2, Huang Ning1, Tian Jingjing1, Feng Yukang1, Sun Shengbin1,2, Jiang Guozhi1,2

(1.Shineway Pharmaceutical Co．，Ltd．， Hebei 051430 ，China；2.Hebei Engineering Center for Chinese medicine injections,Hebei 051430,China)

Objective:To inspect the influence on Dengzhanhuasu Injection by using four different ultrafiltration membranes and select one applicable for manufacturing.Methods:Determining the bacterial endotoxin,content,related substance and membrane flux before and after Dengzhanhuasu Injection was filtered respectively by 10KD PES membrane,10KD cellulose membrane,30KD PES and 30KD cellulose membrane.Results:The filtering effects of four membranes are different.Membrane of 10KD owed higher retention rate of content and related substance but lower pure water flux recovery rate.PES membranes owed higher membrane flux and faster speed than cellulose.Conclusion:10KD PES membrane is applicable for manufacturing Dengzhanhuasu Injection with effectively removing the bacterial endotoxin and impurity,retaining effective components and higher membrane flux.

Dengzhanhuasu;Ultrafiltration Membrane;Bacterial Endotoxin;Content Determination

2014-02-10

張巖巖(1986-)，男，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司助理工程師，研究方向?yàn)橹兴幑に嚰夹g(shù)。

R284.2

A

1673-2197(2014)09-0023-02