羅永會(huì)，張翠香，徐春萍，左紹遠(yuǎn)，劉云春

(大理學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ，云南 大理 671000)

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海棠果中總黃酮的含量測(cè)定

羅永會(huì)，張翠香，徐春萍，左紹遠(yuǎn)，劉云春

(大理學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 ，云南 大理 671000)

目的：建立海棠果中總黃酮的含量測(cè)定方法。方法：以蘆丁為對(duì)照品，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色，采用分光光度法測(cè)定海棠果中總黃酮的含量。結(jié)果：海棠果中總黃酮的含量為10.04%，精密度實(shí)驗(yàn)RSD為0.78%；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD為2.30%,在90min內(nèi)穩(wěn)定性較好；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD為0.69%；蘆丁對(duì)照品濃度在0～100μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為:Y= 0.010 9X-0.001 2，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 8；平均加樣回收率為98.71% ，RSD為1.38%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，可用于海棠果中總黃酮的含量測(cè)定。

海棠果；總黃酮；蘆??；含量測(cè)定

黃酮類化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，廣泛存在于蔬菜、水果及藥用植物中，是植物在長(zhǎng)期自然選擇過程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物,具有抗炎、抗病毒、利膽、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛以及降壓、降血脂、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[1-4]。近年來黃酮類化合物成為新藥開發(fā)研究中一個(gè)非常重要的資源，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

海棠果(Malus prunifolia)又名楸子、海紅、紅海棠果、柰子，屬薔薇科(Ro-saceae)、蘋果亞科(Maloideae)，落葉小喬木[5]。原產(chǎn)我國(guó)，現(xiàn)主要分布在華北、河北、東北南部，內(nèi)蒙古及西北也有。云南西北部的大理、麗江等地區(qū)亦有種植。民間認(rèn)為：海棠果能解毒生津，健胃止渴，降火利尿，助消化，預(yù)防和治療便秘，對(duì)小兒尿道炎有特效，是一種純正的天然保健珍品，長(zhǎng)期食用海棠果產(chǎn)品有健腦、增強(qiáng)免疫力、抗疲勞等作用，尤其是具有抗腫瘤作用[6-8]。但有關(guān)海棠果總黃酮的研究尚未見報(bào)道，本研究采用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)提取海棠果總黃酮的最佳條件進(jìn)行探索，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，為進(jìn)一步開發(fā)海棠果提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料和試劑

海棠果購(gòu)于云南麗江市古城農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。蘆丁、石油醚(沸程60～90℃)、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 主要儀器

BT-224S型電子分析天平( 德國(guó)賽多利斯儀器公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；TDL-4A低速離心機(jī)(上海菲恰爾儀器有限公司)；722E分光光度計(jì)(上海分析儀器有限公司)；RA-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；中藥粉碎機(jī)。

1.3 樣品預(yù)處理

海棠果果干于60℃干燥24h，粉碎。加入10倍體積的石油醚，65℃水浴回流2h，重復(fù)2次，脫脂及去除色素，室溫?fù)]干有機(jī)溶劑，干燥得脫脂海棠果粉樣品，備用。

2 方法與結(jié)果[9-16]

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取120 ℃干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品100.0mg，用50%乙醇定容至100mL，則蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為1.0mg/mL，準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，置于10mL試管中，分別加50%乙醇至2.0mL混勻，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL混勻，放置6min，加10%的硝酸鋁溶液0.3mL混勻，放置6min后加5%的氫氧化鈉溶液2.0mL，混勻，放置15min加50%乙醇至10.0mL混勻，以第1管為空白對(duì)照，于510nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(510nm)

求得回歸方程為:Y= 0.010 9X-0.001 2，R2=0.999 8。蘆丁對(duì)照品濃度在0 ～ 100 μg /mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2 海棠果總黃酮提取方法的確定

通過對(duì)提取溶劑的濃度、料液比、溫度、時(shí)間等單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)主要的提取影響因素進(jìn)行考察。結(jié)果如下。

2.2.1 料液比對(duì)黃酮含量的影響 采用65%的乙醇，分別以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶60、1∶100料液比，40℃提取1.5h，提取1次，測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果如圖2，隨料液比的增加，總黃酮的含量也隨之增大，料液比為1∶60時(shí)達(dá)到最大為7.54%，故海棠果總黃酮提取的最佳料液比為1∶60。

圖2 黃酮含量與料液比的關(guān)系

2.2.2 溫度度對(duì)總黃酮含量的影響 按1∶60料液比，采用65%的乙醇，分別以20、40、60、70、80、90、100℃為提取溫度，提取1.5h，提取1次，測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果如圖3，隨溫度的升高，總黃酮的含量隨之增大，溫度達(dá)到80℃時(shí)，含量達(dá)到最大，之后則隨溫度的升高反而降低。故海棠果總黃酮的提取溫度選擇80℃。

圖3 黃酮含量與提取溫度的關(guān)系

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響 采用65%的乙醇按1∶60的料液比，80℃分別提取0.5、1.0、1.5、 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，提取1次，測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果如圖4。隨時(shí)間增長(zhǎng)，海棠果總黃酮的含量有所增加，當(dāng)提取時(shí)間為3h時(shí)，達(dá)到最大含量9.65%，之后隨時(shí)間增長(zhǎng)則降低。故海棠果提取的時(shí)間為3h。

圖4 黃酮含量與提取時(shí)間的關(guān)系

2.2.4 乙醇濃度對(duì)總黃酮含量的影響 分別用0%(去離子水)、20%、30%、40%、50%、65%、80%、95%乙醇濃度，按料液比為1∶60(g/mL)，40 ℃提取3.0 h，提取1次，測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果如圖5，隨乙醇濃度的增加總黃酮含量隨之增大，當(dāng)乙醇濃度增加到50%時(shí)，海棠果總黃酮含量達(dá)到最大為9.92%，之后則隨乙醇濃度的增加，總黃酮含量則反而降低。故黃酮提取的乙醇濃度為50%。

圖5 黃酮含量與乙醇濃度的關(guān)系

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從料液比、浸提溫度、乙醇濃度、浸提時(shí)間四個(gè)因素綜合考慮，選擇料液比為1∶60(g/mL)、浸提溫度為80℃、50%乙醇為浸提劑、浸提時(shí)間為3.0h，提取海棠果中的總黃酮，可得到較好的效果。

2.2.5 海棠果總黃酮提取液的制備及含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取1.00g脫脂海棠果粉，按1∶60(g/mL)料液比，用50%乙醇為浸提劑,80℃浸提3.0h，過濾，用50%乙醇溶液定容到100mL，得總黃酮提取液，備用。準(zhǔn)確吸取1.0mL置于50mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容到刻度。吸取2.0mL，按照“2.1”方法操作，于510nm處讀取吸光度,代入線性回歸方程，求出樣品液中總黃酮濃度，計(jì)算海棠果中總黃酮的含量約為10.04%。

海棠果中總黃酮的含量=C×V×N×10-6/M×100%

其中：C：樣品總黃酮濃度(μg/mL)，M：海棠果干粉質(zhì)量(g)，V：待測(cè)樣品總體積(mL)，N：待測(cè)溶液的稀釋倍數(shù)，10-6：?jiǎn)挝粨Q算(1g=10-6μg)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取總黃酮提取液2.0mL，共5份，按“2.1”項(xiàng)方法操作，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，RSD=0.78%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取總黃酮提取液2.0mL，按“2.1”項(xiàng)方法操作，分別放置于室溫0、15、30、60、90min之后，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD=2.30%，表明其在顯色后的90min內(nèi)穩(wěn)定性較好。結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取脫脂海棠果粉1.00 g，共5份，按“2.2.5”項(xiàng)方法提取總黃酮，按“2.1”項(xiàng)方法操作，分別在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮含量， RSD=0.69%，表明試驗(yàn)的重復(fù)性良好。結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn) (n=5)

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取脫脂海棠果粉5份，每份為0.5 g，分別加入1.0 mg/mL蘆丁1.0 mL，按“2.2.5”項(xiàng)方法提取總黃酮，按“2.1”項(xiàng)方法操作，分別在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，平均回收率為98.71%，RSD=1.38%，表明測(cè)定方法可靠性強(qiáng)。結(jié)果見表4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)提取溶劑濃度、料液比、溫度及提取時(shí)間等單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，建立了海棠果總黃酮的提取方法：以1∶60的料液比用50%乙醇在80 ℃浸提3.0h。以蘆丁為對(duì)照品，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色，采用分光光度法測(cè)定海棠果中總黃酮的含量。精密度實(shí)驗(yàn)RSD為0.78%；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD為2.30%,在90min內(nèi)穩(wěn)定性較好；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD為0.69%；平均加樣回收率為98.71% ，RSD為1.38%。該方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，為海棠果的開發(fā)利用奠定了一定基礎(chǔ)。海棠果中含有豐富的總黃酮，平均含量達(dá)10.04%，具有較高的研究?jī)r(jià)值。

[1] 古力伯斯坦·艾達(dá)爾，外塔尼古麗·卡米爾.丁香中總黃酮含量測(cè)定及提取工藝研究[J].中國(guó)釀造， 2011(8)：32-34.

[2] 李光，余霜，鄧銀，等.甘薯葉總黃酮含量的測(cè)定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(12)：152-154.

[3] 高健，李鳳偉.薺菜總黃酮的提取工藝條件研究[J].鹽城工學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，24(2)：7-10.

[4] 湯春妮.黃花草木樨中總黃酮的提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012，40(5):2661-2663.

[5] 趙宗桓，李映彩，木偉軍，等.麗江市退耕還林海棠果造林模式研究[J].西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，28(2)： 30-32，37.

[6] 余森艷，張叔枝，朱 倩.海棠果酶法提汁工藝的優(yōu)化研究[J].食品科學(xué)：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013(3)：323-324.

[7] 劉軍，牛鳳吾，朱思屹.海棠果系列產(chǎn)品的研究與開發(fā)[J].新疆大學(xué)學(xué)報(bào)：理工版，2001，18(4)： 476-478.

[8] 梅文泉，和承堯，汪祿祥，等.云南麗江海棠果開發(fā)利用研究[J].云南農(nóng)業(yè)科技，2002(6)：41-42.

[9] 朱艷琴，殷勤紅，楊俊，等.超聲醇溶-紫外分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地三七花中總黃酮含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(1)：187-189.

[10] 張周菊，李森，何再安，等.空心蓮子草總黃酮的含量測(cè)定[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14(1)：38-40.

[11] 段志濤，高英，霍文杰，等.桑白皮中總黃酮含量測(cè)定方法研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(7)：133-135.

[12] 陳雪梅，甄漢深，王雯慧，等.紅陽(yáng)獼猴桃總黃酮的含量測(cè)定[J].廣西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，16(2)：82-84.

[13] 王英豪，魏國(guó)強(qiáng)，張理平.馬齒莧總黃酮含量測(cè)定方法的建立[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，22(2)：44-46.

[14] 曲中堂，王光利，項(xiàng)昭保，等.青果總黃酮的含量測(cè)定[J]. 食品工業(yè)科技,2012(7):91-293，297.

[15] 張明，陳華國(guó)，趙超，等.杠板歸中總黃酮的含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2012，18(18)：77-80.

[16] 李登昌，陳毓.香水百合花中總黃酮含量的測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(15): 6900-6901.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Determination Total Content of Flavonoids from Chinese Flowering Crabapple

Luo Yonghui, Zhang Cuixiang, Xu Chunping，Zuo Shaoyuan，Liu Yunchun

(Pre-clinical College，Dali University, Yunnan 671000, China)

Objective:To establish the method of determination the total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple.Methods:Taking rutin as the standard sample and colored by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH solution, the total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple was determined by the spectrophotometric method.Results:The total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple was 10.04%. The RSDs of the precision test, the stability test and the repetitive test were 0.78% , 2.30% and 0.69% respectively. There was a better linear relation with the concentration of rutin standard in the range of 0～100μg/mL. The regression equation wasY=0.010 9X-0.001 2, and the square of correlation coefficient R2=0.9998. The average recovery rate was 98.71% (RSD=1.38%).Conclusion:The method is simple and stable, and may be used to determine the total content of flavonoids from Chinese flowering crabapple.

Chinese Flowering Crabapple; Total Flavonoids; Rutin; Content Determination

2014-01-07

羅永會(huì)(1967-)，女，白族，大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)和植物成分的提取。

R284.2

A

1673-2197(2014)09-0020-03