羅艷平，王建霞

(深圳九新藥業(yè)有限公司，廣東 深圳 518049)

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HPLC法測定7-ACT相關(guān)雜質(zhì)含量

羅艷平，王建霞

(深圳九新藥業(yè)有限公司，廣東 深圳 518049)

目的：建立頭孢曲松鈉生產(chǎn)中中間體7-ACT相關(guān)雜質(zhì)的HPLC測定方法。方法：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(0.15m×4.6mm×1.0μm)，紫外檢測器，檢測波長：270nm，流動相：3.2g四庚基溴化銨置400mL乙腈中，加入44mL pH7.0磷酸鹽緩沖液和4mL pH5.0枸櫞酸鹽緩沖液，加水稀釋至1 000mL，過濾，流速：1.0mL/min,進(jìn)樣量20μL，自身對照法測定7-ACT的相關(guān)雜質(zhì)含量。結(jié)果：7-ACT在0.06～3.6ppm濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.9999)，精密度RSD(n=6)為1.4%；定量限：7-ACT、7-ACA達(dá)到0.048ppm，三嗪環(huán)達(dá)到0.012ppm。結(jié)論：本方法專屬性強(qiáng)，操作簡便，結(jié)果可靠，可用于7-ACT中相關(guān)雜質(zhì)的測定。

高效液相色譜法；7-ACT；反相色譜柱；相關(guān)雜質(zhì)

頭孢曲松鈉為半合成的第三代頭孢菌素，對大多數(shù)革蘭陽性菌和陰性菌都有強(qiáng)大抗菌活性，抗菌譜包括綠膿桿菌、大腸桿菌、肺炎桿菌、流感嗜血桿菌、產(chǎn)氣腸細(xì)菌、變形桿菌屬、雙球菌屬及金葡菌等。7-ACT是生產(chǎn)頭孢曲松鈉的中間體，因此在生產(chǎn)過程中的起始物料(7-ACA、三嗪環(huán))的殘留及未知雜質(zhì)的控制，對終端產(chǎn)品雜質(zhì)控制起關(guān)鍵性的作用。本文建立了高效液相色譜法測定7-ACT的相關(guān)物質(zhì)，方法簡單，重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

HPLC：安捷倫(含在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、四元泵、柱溫箱、多波長紫外檢測器)；7-ACT：(深圳九新藥業(yè)有限公司，批號：110401，110402，110403)；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、枸櫞酸鈉、枸櫞酸、乙腈、四庚基溴化胺為分析純或色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；規(guī)格：l=0.15m，Φ=4.6mm；流動相：取3.2g四庚基溴化銨置400mL乙腈中，加入44mL pH7.0磷酸鹽緩沖液和4mL pH5.0枸櫞酸鹽緩沖液，加水稀釋至1 000mL,過濾。流速：1.0mL/min,檢測器：紫外檢測器，檢測波長：270nm,進(jìn)樣量： 20μL，運(yùn)行時(shí)間：2.5倍主峰保留時(shí)間。按自身對照法計(jì)算雜質(zhì)含量。

2.2 溶液制備

2.2.1 pH7.0磷酸鹽緩沖液 取磷酸氫二鉀1.36g，磷酸二氫鉀0.4g，置100mL水中溶解后，用磷酸溶液(80%)或氫氧化鉀溶液(10mol/L)調(diào)節(jié)pH至(7.0±0.1)。

2.2.2 pH5.0枸櫞酸鹽溶液 取2.58g枸櫞酸鈉于50mL水中溶解后，用枸櫞酸(5g溶解在25mL水中)調(diào)節(jié)pH至(5.0±0.1)。

2.2.3 測試溶液 取供試品約30mg，加流動相100mL使溶解，搖勻，即得。

2.2.4 參照溶液(a) 取測試溶液1.0 mL，用流動相稀釋定容至100.0mL。

2.2.5 參照溶液(b) 分別取5.0mg 7-ACA、三嗪環(huán)對照品及5.0mg 7-ACT對照品，用流動相溶解稀釋定容至100.0mL。

2.3 專屬性及系統(tǒng)適用性(參照溶液b)

取參照溶液b，進(jìn)樣，結(jié)果顯示：分離度大于1.5，見表1。系統(tǒng)適用性考察見圖1。

表1 專屬性及系統(tǒng)適用性考察

圖1 系統(tǒng)適用性考察

2.4 線性關(guān)系考察

儲備溶液：稱取30mg 7-ACT，用流動相溶解并定容至100mL。取10mL此溶液用流動相溶解并定容至100mL。0.02%API溶液： 取儲備溶液1mL用流動相溶解并定容至50mL，取此溶液1.0mL用流動相溶解并定容至10mL。0.03%API溶液： 取儲備溶液1mL用流動相溶解并定容至50mL，取此溶液1.5mL用流動相溶解并定容至10mL。0.24%API溶液：取儲備溶液0.60mL用流動相溶解并定容至25mL。0.36%API溶液：取儲備溶液0.90mL用流動相溶解并定容至25mL。0.60%API溶液：取儲備溶液1.50mL用流動相溶解并定容至25mL。1.20%API溶液：取儲備溶液3.00mL用流動相溶解并定容至25mL。

計(jì)算每份溶液進(jìn)樣3次的主峰面積的RSD，記錄色譜圖，以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示：7-ACT在所選濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程：Y=64 185X+1.5817，相關(guān)系數(shù)：0.999 9，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9。見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度考察

取參照溶液(a)，連續(xù)進(jìn)樣6次， 計(jì)算7-ACT峰面積RSD，結(jié)果顯示：本方法的精密度良好。見表3。

表3 精密度測定結(jié)果

2.6 檢測限和定量限測定

儲備溶液：制備7-ACA三嗪環(huán)及7-ACT溶液，濃度為0.003mg/mL。檢測限：用儲備溶液不斷稀釋測試直至峰高與噪聲比值為3。定量限：用儲備溶液不斷稀釋測試直至峰高與噪聲比值為10。檢測限和定量限測定結(jié)果結(jié)果見表4、圖2。結(jié)果顯示對以上雜質(zhì)檢測靈敏。

表4 檢測限和定量限測定結(jié)果

2.7 中間精密度

2個(gè)分析檢驗(yàn)人員，3天，分別取樣品1批，按"3.3"項(xiàng)下方法配制，分別精密取測試溶液和參照溶液(a)20μL，用自身對照法計(jì)算樣品的7-ACA、三嗪環(huán)、最大未知雜質(zhì)的結(jié)果，并計(jì)算結(jié)果的RSD。見表5。

圖2 7-ACA檢測限及定量限

圖3 三嗪環(huán)檢測限及定量限

圖4 7-ACT檢測限及定量限

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測定

取樣品3批(批號：110401，110402，110403)1.0g，按“3.3項(xiàng)”下方法配制，分別精密取測試溶液和參照溶液(a)20μL，用自身對照法計(jì)算3批樣品的7-ACA、三嗪環(huán)、最大未知雜質(zhì)，測定結(jié)果見表6，色譜見圖5。

2.9 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取樣品1批，按“3.3”項(xiàng)下方法配制，在冷處/常溫環(huán)境下，分別于0h、1h、2h、3h、4h時(shí)間取樣品，測試溶液。溶液在冷處放置1h內(nèi)是穩(wěn)定的，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。結(jié)果見表7。

圖5 對照溶液及樣品溶液色譜

表6 樣品雜質(zhì)測定結(jié)果

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本測定方法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果證明五種溶劑峰的理論塔板數(shù)均大于5 000，相互分離度均遠(yuǎn)大于1.5，說明能良好分離，且沒有干擾。

精密度考察結(jié)果證明五種溶劑峰面積的RSD均小于5.0%，本測定方法精密度符合要求。

回收率試驗(yàn)結(jié)果證明五種溶劑、三種濃度回收率均在90.0%～110.0%之間，3次平行測定的RSD均小于5.0%，本測定方法準(zhǔn)確性符合要求。

本測定方法專屬性強(qiáng)，操作簡便，結(jié)果可靠，可用于頭孢替坦二鈉中五種殘留溶劑的同時(shí)測定。

[1] 周海鈞.藥品注冊的國際技術(shù)要求.質(zhì)量部分[M]．北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:126-140.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄ⅧP.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

HPLC Method Determination of Related Substance in 7-ACT

Luo Yanping, Wan Jianxia

(Shenzhen Gosun Pharmaceutical Co.,LTD.,Shenzhen 518049,China)

Objective:To establish a method for determination of related substance of 7-ACT by High Performance Liquid Chromatography. Methods:The column was octadecylsilane chemically bonded silica. Mobile phase - Dissolve 2.0 g of tetradecylammonium bromide in 400 mL of acetonitrile, add 44 mL of pH 7.0 phosphate buffer and 4.0mL of pH 5.0 citric acid buffer, and dilute to 1000 mL with water, membrane filtered.Detector: VWD Wavelength of detection：270nm ,Flow rate：1.0mL/min; Injection Volume : 20 ul,A self-calibrated method for determination of related substance of 7-ACT.Results:Under the above condition, there is a good linear relationship in the concentration range measured.Conclusion:The method is simple, accurate and reproducible. Can be used for determination for determination of related substance of 7-ACT.

High Performance Liquid Chromatography; 7-ACT, Reversed-phase Chromatography Column; Related Substance

2014-11-28

羅艷平(1964-)，女，深圳九新藥業(yè)有限公司工程師，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)。

R927.2

A

1673-2197(2014)09-0014-04