李忠生 王智群 馮秀娟

犬瘟熱病毒檢測技術的研究進展

李忠生 王智群 馮秀娟

犬瘟熱（CDV）在1809年由Jeneer首次報道。1905年卡爾（Carre）將分離的濾過性致病因子接種動物從而復制出病例，1926年Laidlaw和Duncan利用完全隔離的犬和易感性高的雪貂進行了人工感染，該試驗肯定了本病的病原為病毒。1980年我國首次分離并獲得了犬瘟熱病毒。犬瘟熱常引起大批犬、貂、狐等動物發(fā)病，死亡率可達30～80%，繼發(fā)細菌感染是導致死亡率增高的主要原因之一,若并發(fā)肺炎其死亡率可高達90%以上。國內(nèi)外對CDV進行了大量研究, 建立了多種實驗室檢測方法。下面我們從病毒分離、免疫學和分子生物學等方面對犬瘟熱病毒檢測技術進行闡述。

一、病毒的分離鑒定

病毒的分離培養(yǎng)是確診犬瘟熱最根本的診斷方法。但由于CDV對外界環(huán)境的抵抗力弱，致使病毒的分離成功率很低，此外病毒分離成功率還與分離病毒的細胞、動物的抗體水平、病料采樣的時間部位、樣品處理方法等因素有關。目前培養(yǎng)CDV的細胞有原代培養(yǎng)細胞和傳代細胞系兩類。原代培養(yǎng)細胞主要有犬或貂的肺巨噬細胞、雞胚成纖維細胞（CEF）、犬腎原細胞、牛胚胎肺細胞、犬腦細胞（DB）等；細胞系有犬腎細胞系（MDCK）、非洲綠猴腎細胞系（Vero）、貓腎細胞系（CRFK）、貓胚胎細胞系（FE）等。有報道稱能夠表達犬淋巴細胞激活信號分子的細胞，對分離CDV非常有效，在感染細胞1天后即可檢測到病毒，極大地減少傳統(tǒng)分離方法的耗費。病料可采用急性病例的胸腺、脾、肝、肺、淋巴結(jié)，發(fā)病早期的病例可采淋巴組織，有腦炎癥狀的病例可采小腦等。

病毒鑒定可采用電子顯微鏡對病毒粒子形態(tài)學進行觀察，也可以采用常規(guī)方法進行病毒理化試驗，還可以進行動物回歸試驗，觀察是否有犬瘟熱癥狀。

二、免疫學檢查方法

（一）瓊脂免疫擴散試驗

瓊脂免疫擴散試驗只能粗略地對抗體進行測定，靈敏性略差，因為不需要使用特殊儀器且容易操作，較適合在基層應用。任文陟等用病死貉肝臟為抗原，以犬瘟熱雞胚成纖維細胞弱毒疫苗免疫綿羊制備瓊脂擴散抗體，建立了瓊脂擴散試驗方法。該方法與電鏡檢查結(jié)果總符合率為90%。

（二）SPA協(xié)同凝集試驗

SPA協(xié)同凝集試驗主要用于感染犬瘟熱動物血清中抗體的檢測，具有快速、特異、易于操作、樣品可長期保存等優(yōu)點，易于推廣。劉鼎新等采用這種方法和瓊擴試驗分別對臨床疑似犬瘟熱的病犬進行檢測，結(jié)果表明兩種方法結(jié)果一致。劉潤珍等制備了犬瘟熱快速診斷試劑，并確定了制備工藝及標準操作程序，3～5 min內(nèi)即可獲得診斷結(jié)果。利用糞便和尿液檢查抗原不受疫苗接種的干擾。

（三）免疫組化技術

免疫組化技術主要用于犬瘟熱的死后診斷，因其能檢測CDV在各組織臟器的分布情況，可以為檢測樣品的篩選提供依據(jù)，但其需要特異的抗體結(jié)合反應。本法不須用熒光顯微鏡、標本可以長期保存，這些都是優(yōu)于熒光抗體法之處。顯色后的標本可在普通顯微鏡下觀察，抗原所在部位DAB顯色液呈棕黃色，還可用常規(guī)染料作反襯染色，細胞結(jié)構(gòu)更清晰，有利于抗原的定位。遇秀玲等采用免疫組化間接BA法，對疑似CD的病犬臟器組織中的抗原進行了定位檢查和系統(tǒng)病理學觀察，結(jié)果表明病犬的多個組織器官均可見抗原陽性反應。Gathumbi等認為該方法也可用于石蠟包埋的組織、福爾馬林固定或培養(yǎng)物中CDV的組織學檢測。

（四）免疫熒光技術

免疫熒光技術是指用熒光素標記抗原或抗體，用熒光顯微鏡觀察熒光以示蹤相應的抗原或抗體的方法。本方法具有反應特異性、染色快速等特點，可在細胞水平上進行抗原定位，是目前國際通用的診斷CDV的公認手段。

Coffin等建立免疫熒光方法來診斷犬瘟熱，認為該方法可促進犬瘟熱的特異性診斷，但是需要特殊設備，且通常需要在專門的試驗室中進行。在試驗室中可用直接或間接熒光素標記的CDV抗體染色，并用熒光顯微鏡進行檢查。

（五）血清中和試驗

中和試驗是根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免疫學試驗，敏感性高、特異性強，是診斷CD、評價CD疫苗免疫效果、監(jiān)測免疫犬抗體水平的標準方法。Appel等利用微量血清中和試驗對樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)此方法具有很高的敏感性和特異性。血清中和試驗雖然有很多優(yōu)點，但試驗所需時間較長，工作量大，通常需幾天，因此不利于CDV快速診斷。

（六）酶聯(lián)免疫吸附試驗

目前ELISA是已用于感染犬血清和腦脊液中病毒性抗原的檢測。其過程是將抗原（或抗體）吸附于固相載體上，然后進行免疫酶反應，底物顯色后用分光光度計或肉眼判斷結(jié)果。ELISA方法包括間接法、夾心法、雙抗體夾心法、競爭法等，該方法具有快速、靈敏、簡便的特點，在CD的流行病學調(diào)查和CD的免疫情況評估工作中常用到該方法，尤其適合規(guī)模很大的樣品的檢測。Blixenkrone-Moller等建立了檢測抗犬瘟熱病毒IgM的ELISA，用于犬和水貂CDV早期感染的檢測。傳統(tǒng)的ELISA方法用犬瘟熱病毒細胞培養(yǎng)物做包被抗原，CDV在細胞上繁殖量低而且抗原提純難度較大，用基因技術有望解決這一難題。簡中友等用重組N蛋白作為包被抗原建立了檢測CDV抗體的間接ELISA方法，并與進口診斷試劑盒比較，符合率分別為92.4%、97.1%。為免疫犬群抗體檢測、CDV的早期診斷和CDV流行病學調(diào)查提供了一種簡便的血清學診斷方法。

（七）免疫膠體金技術

1971年，F(xiàn)aulk和Taylon將兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用免疫膠體金標記技術研究沙門氏菌壁細胞抗原成分，首次將膠體金標記技術引入免疫化學。此后，膠體金作為新型免疫標記技術快速發(fā)展，許多學者進一步證實膠體金穩(wěn)定又能迅速吸附蛋白質(zhì)，可以作為探針精確定位細胞表面及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、激素、抗原等生物大分子。進入20世紀90年代初期，免疫膠體金又與固相膜結(jié)合發(fā)展了以膜為固相載體的免疫膠體金快速診斷技術，它是當前快速敏感的免疫檢測技術之一，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻们熬啊?/p>

膠體金標記抗體實質(zhì)是抗體被膠體金顆粒吸附到表面的過程，這種吸附屬于物理性吸附，對抗體生物活性影響很小，容易獲得較高的標記率；而膠體金不屬于生物活性物質(zhì)，大大減少了干擾檢測結(jié)果的因素。膠體金免疫層析技術是用于肉眼水平的免疫檢測，具有試劑和樣本用量小、肉眼易判斷、攜帶方便、敏感度和特異性高、結(jié)果可長期保存、不需特殊設備等優(yōu)點，適用于現(xiàn)場大量樣本的檢測。用膠體金標記抗CDV的單克隆抗體，然后與樣品中的CDV結(jié)合，形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出肉眼可見的紅色條帶。該法靈敏度高、特異性強，操作簡便、快速，結(jié)果準確、易于判讀。

三、分子生物學診斷方法

分子生物學的發(fā)展為犬瘟熱的研究開辟了新的途徑，并提供了多種新的檢測方法和手段，CDV致病機理、分子病毒學以及免疫學等許多相關研究得以迅速的發(fā)展，其中分子生物學診斷技術研究也得到快速的發(fā)展，但這些診斷方法尚處在試驗室階段。利用分子生物學技術克隆表達CDV主要的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，盡快研制出特異性診斷抗原或特異核酸探針，對本病的診斷有重要意義，該技術將來有著廣闊的前景和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

（一）核酸雜交技術

核酸分子雜交技術是將具有互補核苷酸序列的兩條單股核酸分子放入同一反應體系中，兩條互補鏈重新締合成雙鏈。該技術也是一種分子雜交技術，是免疫學診斷技術后發(fā)展的一項以分子生物學為基礎的新技術，具有敏感性高、特異性強等特點。Zurbriggen等用地高辛標記的CDV N基因互補的特異性RNA做為探針，可檢測到單個感染細胞中存在的目的核酸序列，特異性較強。李金中等根據(jù)Barret報道的CDV Onderstepoort株F基因序列，在國內(nèi)首次建立了犬瘟熱病毒RT-PCR診斷方法，并成功的應用于臨床診斷。盡管此種方法具有很多優(yōu)點，但核酸雜交技術受設備、操作人員等多種條件的影響而難于在臨床推廣。

（二）PCR技術

PCR技術能對病毒特異性核酸片段進行檢測，具有敏感性高、特異性強等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應用于病毒檢測。其中反轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈式反應(RT-PCR)診斷法的敏感性和特異性均高于傳統(tǒng)診斷方法，因而RTPCR廣泛應用于臨床樣品中的病毒檢測。尤其在犬瘟熱發(fā)病早期，對機體特異性免疫抗體無法檢測時RTPCR非常有效。

Chulakasian等根據(jù)F基因、M基因之間非編碼區(qū)的區(qū)別設計多重擴增穩(wěn)定突變體系PCR方法（ARMSPCR）也能達到區(qū)分自然感染后發(fā)病還是疫苗引起的癥狀的目的。黃國君等和Gabriella等等分別建立SYBR Green Real-time RT-PCR和 TaqMan Real-time RT-PCR檢測CDV，均獲得較高的敏感性和特異性，最小檢測量為100個RNA，動物的各種組織和器官均可用來檢測。

四、其它實驗室方法

（一）離子捕獲電鏡檢查法

采用電鏡是直接檢測CDV的一種簡便、快速的方法，但很難與同科的其他病毒相區(qū)別，所以一般不作為常規(guī)手段。離子捕獲電鏡檢查法通過濃縮和提純病毒而提高檢出率，比常規(guī)電鏡技術的結(jié)果好，且只需2～3 h，快速準確。常國權等用離子捕獲電鏡技術檢測CDV，結(jié)果顯著好于常規(guī)電鏡技術。房紅瑩等改良了離子捕獲電鏡法，將其與免疫電鏡技術結(jié)合，效果又比單純離子捕獲電鏡法好，提高了完整CDV粒子的檢測率。

（二）包涵體檢查法

包涵體的檢查是診斷CD的重要輔助方法。因為CDV與狂犬病病毒、犬傳染性肝炎病毒等所形成的包涵體及細胞某些反應產(chǎn)物難以區(qū)分，易出現(xiàn)假陽性，所以還要與其它方法相結(jié)合才能確診。未死亡的病犬，刮取鼻、眼結(jié)膜、瞬膜和膣等粘膜；死亡的犬，刮取膀胱、膽管、膽囊等黏膜。包涵體大多存在于胞漿內(nèi)，一個細胞內(nèi)可能有1～10個圓形或橢圓形的包涵體。程世鵬等研究發(fā)現(xiàn)包涵體在用強毒的狐和貂的膀胱黏膜涂片中存在，而注射疫苗組和對照組則包涵體的存在。Kolbl等在研究病犬的血液變化時發(fā)現(xiàn)，在染色的血液涂片中常能檢出包涵體，其中淋巴細胞檢出少，單核細胞、嗜中性白細胞和紅細胞檢出更少。

（作者單位:李忠生、馮秀娟，公安部南京警犬研究所,210012）
（王智群， 南京金盾動物藥業(yè)有限責任公司,210012）