陳歆然 葉蘭香 廖松潔 龔瓊 余劍

實驗性腦梗死后硫酸軟骨素蛋白多糖的表達☆

陳歆然*葉蘭香*廖松潔*龔瓊*余劍*

目的 觀察高血壓大鼠大腦皮質(zhì)局灶梗死后病灶周圍皮質(zhì)及其同側(cè)丘腦抑制性蛋白—硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)的表達并探討其對神經(jīng)可塑性的可能作用。方法建立高血壓大鼠的右側(cè)大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，假手術(shù)(Sham)組僅暴露而不凝閉MCA，每組24只。MCAO或Sham后第7天和第14天，各組各時間點取12只大鼠按改良神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity scores,mNSS)進行神經(jīng)功能評分后，處死取腦，免疫熒光及western bolt檢測梗死灶周圍皮質(zhì)及其同側(cè)丘腦CSPGs及其組分NG2、Neurocan的表達。結(jié)果MCAO后大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損；MCAO術(shù)后第7天梗死灶周圍皮質(zhì)及其同側(cè)丘腦CSPGs、NG2及全長Neurocan與Sham組相比表達均增加，并持續(xù)至第14天(P＜0.05)，但第7天與第14天的表達相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；術(shù)后第7天和第14天C端片段的Neurocan在上述部位的表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論CSPGs可能通過提供抑制性環(huán)境參與腦梗死后病灶局部及遠隔丘腦的神經(jīng)可塑性。

硫酸軟骨素蛋白多糖 腦梗死 丘腦 神經(jīng)可塑性

硫酸軟骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)是一組由神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞等合成并分泌的共價結(jié)合硫酸糖胺聚糖鏈蛋白，其成員眾多，Neurocan和NG2是CSPGs家族中兩個主要組分[1-2]。成年CNS損傷后，CSPGs在病灶周圍內(nèi)表達大多顯著上調(diào)，在細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)內(nèi)形成抑制性環(huán)境，阻礙神經(jīng)再生[3]。目前針對CNS損傷后CSPGs的研究大多采用脊髓損傷模型，對卒中后CSPGs的表達研究較少，且尚無結(jié)合梗死灶局部及遠隔丘腦的研究。在本研究中，我們觀察高血壓大鼠一側(cè)大腦皮質(zhì)梗死后病灶周圍皮質(zhì)及同側(cè)丘腦CSPGs及NG2、Neurocan的表達，并探討其對CNS可塑性的可能作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備按雙腎雙夾法復(fù)制Sprague-Dawley大鼠(廣東省醫(yī)學(xué)動物中心)易卒中型腎血管性高血壓模型[4]。術(shù)后12周，隨機選取24只血壓穩(wěn)定在180mmHg以上，無自發(fā)性卒中癥狀的大鼠，其中12只制備右側(cè)大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型[5]。其余12只僅暴露而不凝閉MCA，作為假手術(shù)(Sham)組。術(shù)前1天及術(shù)后第7、14天各組大鼠按mNSS法行神經(jīng)評分[6]。

1.2 腦組織準備手術(shù)后第7天和第14天，選取MCAO組和Sham組各12只大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，其中6只經(jīng)升主動脈4%多聚甲醛灌注固定，快速斷頭取腦，后固定8 h，O.C.T包埋，經(jīng)丘腦層面冠狀冰凍切片，片厚10μm；其余6只大鼠經(jīng)升主動脈灌注4℃生理鹽水，快速斷頭取腦，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫熒光取冰凍切片行免疫熒光法檢測。一抗分別為單克隆小鼠抗大鼠CSPGs(1:400,Sigma)、NG2(1:500,Chemicon)、Neurocan(1:500,Chemicon)抗體。次日滴加Alexa Fluor 594驢抗小鼠(1: 500,Invitrogen)的二抗，室溫孵育1h，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡觀察CSGP、NG2及Neurocan的表達水平。

1.4 Western Blot取梗死灶周圍皮質(zhì)及同側(cè)丘腦，采用組織裂解法提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品進行SDS-PAGE垂直電泳，每孔50 μg。轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入單克隆小鼠抗大鼠NG2(1:1000)、Neurocan (1:1000)抗體，4℃搖床過夜，次日加入偶聯(lián)辣根過氧化物的山羊抗小鼠抗體(1:2000,Chemicon)，室溫搖床1 h，Millipore發(fā)光液中感光盒內(nèi)曝光。采用Image J軟件進行圖像分析，目的蛋白條帶與β-actin的吸光度比值即為目的蛋白的相對值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0分析數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)以（）表示。兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗；多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。檢驗水準ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分兩組大鼠mNSS基線評分相等。Sham組后第1、7及14天，mNSS評分顯示大鼠運動、感覺及平衡等功能均正常。與Sham組相比，MCAO組后第1、7及14天mNSS評分較Sham組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。MCAO組大鼠運動、感覺及平衡等功能不同程度受損(圖1)。

2.2 免疫熒光Sham組大鼠皮質(zhì)及同側(cè)丘腦CSPGs、NG2及Neurocan均無明顯表達。MCAO后第7天，CSP-Gs(圖2)、NG2(圖3)及Neurocan(圖4)在梗死灶周圍皮質(zhì)及同側(cè)丘腦表達均增加，并持續(xù)至第14天。其中可見梗死灶周圍皮質(zhì)的陽性值較同側(cè)丘腦多，但第7天與第14天相比，表達無明顯差異。

2.3 Western blotSham組大鼠皮質(zhì)及同側(cè)丘腦NG2呈輕度表達。與Sham組相比，MCAO后第7天和第14天梗死灶周圍皮質(zhì)及同側(cè)丘腦NG2表達明顯增加(P＜0.05)。Sham組大鼠皮質(zhì)及同側(cè)丘腦Neurocan的表達有兩種趨勢：其中一個分子量約為245KD的全長Neurocan無明顯表達，另一個分子量約為180KD的C端片段Neurocan呈中度表達；與Sham組相比，MCAO后第7天和第14天梗死灶周圍皮質(zhì)及同側(cè)丘腦全長的Neurocan表達明顯增多(P＜0.05)；而C端片段Neurocan表達無明顯差異(P＞0.05)(圖5)。

3 討論

圖2 Sham/MCAO后第7和第14天CSPGs在梗死灶周圍皮質(zhì)及同側(cè)丘腦的表達。A:Sham組皮質(zhì)；B:MCAO組第7天梗死灶周圍皮質(zhì)；C:MCAO組第14天梗死灶周圍皮質(zhì)；D:Sham組同側(cè)丘腦；E: MCAO組第7天同側(cè)丘腦；F:MCAO組第14天同側(cè)丘腦。標(biāo)尺=40 μm

圖3 Sham/MCAO后第7和第14天NG2在梗死灶周圍皮質(zhì)及同側(cè)丘腦的表達。A:Sham組皮質(zhì)；B:MCAO組第7天梗死灶周圍皮質(zhì)；C:MCAO組第14天梗死灶周圍皮質(zhì)；D:Sham組同側(cè)丘腦；E: MCAO組第7天同側(cè)丘腦；F:MCAO組第14天同側(cè)丘腦。標(biāo)尺=40 μm

圖4 Sham/MCAO組后第7和第14天Neurocan在梗死灶周圍皮質(zhì)及同側(cè)丘腦的表達。A:Sham組皮質(zhì)；B:MCAO組第7天梗死灶周圍皮質(zhì)；C:MCAO組第14天梗死灶周圍皮質(zhì)；D:Sham組同側(cè)丘腦；E:MCAO組第7天同側(cè)丘腦F:MCAO組第14天同側(cè)丘腦。標(biāo)尺=40μm

本研究發(fā)現(xiàn)，一側(cè)大腦皮質(zhì)梗死后第7天和第14天，梗死灶周圍皮質(zhì)及同側(cè)丘腦CSPGs、NG2、全長Neurocan不同程度表達增加，C端片段Neurocan表達無明顯差異。CSPGs、NG2、全長Neurocan的表達上調(diào)與MCAO后神經(jīng)功能缺失存在時間上的一致性，提示CSPGs可能通過提供抑制性環(huán)境參與腦梗死后病灶局部及遠隔丘腦的神經(jīng)可塑性。

膠質(zhì)疤痕的形成是CNS損傷的病理學(xué)標(biāo)志，其在病灶和周圍正常組織之間形成一道機械屏障，具有限制炎癥反應(yīng)和減輕損傷的作用，但同時也直接阻礙了損傷后的神經(jīng)再生[7]。在膠質(zhì)疤痕中，CSPGs作為ECM的主要成分，被認為起重要的抑制作用[8]。成年大鼠大腦皮層損傷后，病灶周圍形成的膠質(zhì)疤痕內(nèi)，CSPGs、NG2、Neurocan的表達在4周內(nèi)均不同程度上調(diào)[9]；Jones等[10-11]發(fā)現(xiàn)成年大鼠脊髓損傷后，病灶周圍NG2及Neurocan表達明顯上調(diào)，并持續(xù)至4周，形成ECM內(nèi)的主要抑制性環(huán)境，阻礙神經(jīng)再生。我們的實驗結(jié)果也表明，MCAO后，CSPGs、NG2及Neurocan不同程度表達上調(diào)，并持續(xù)至2周。與上述的研究結(jié)果具有不同程度的一致性；同時我們還發(fā)現(xiàn)，CSPGs、NG2、Neurocan在其同側(cè)丘腦部位的表達與Sham組相比也明顯增加。鑒于MCAO術(shù)后僅大腦半球的頂葉、額葉皮質(zhì)出現(xiàn)病變而腦深部結(jié)構(gòu)包括丘腦未受累及，說明丘腦CSPGs、NG2及Neurocan的表達上調(diào)是繼發(fā)于大腦皮質(zhì)局灶梗死后的，提示除了梗死灶局部原發(fā)損害外，遠隔部位的繼發(fā)性損害也值得關(guān)注。此外，本研究還觀察到Neurocan的全長和C端片段表達趨勢不一：前者在Sham組無明顯表達，而梗死后表達明顯升高；后者的表達與Sham組相比無明顯差異性。對于這種結(jié)果的解釋，已有研究表明，全長Neurocan在發(fā)育的大腦中表達較多而在成年正常大腦中檢測不到，但其表達在CNS損傷后再次上調(diào)；而其C端片段的表達量不受CNS損傷的影響，表達較保守[12]。提示全長Neurocan可能參與損傷后的抑制性作用，而C端片段可能為一種結(jié)構(gòu)性成分。

圖5 Sham/MCAO組后第7和第14天NG2、Neurocan在梗死灶周圍皮質(zhì)及同側(cè)丘腦的表達(A)及半定量(B)。＊與Sham組皮質(zhì)比較，P＜0.05；#與Sham組丘腦比較，P＜0.05

一般認為，CSPGs的抑制性作用主要取決于其側(cè)鏈。在CNS損傷后病灶局部應(yīng)用CSPGs特異性側(cè)鏈降解劑—軟骨素酶ABC后，神經(jīng)軸突再生明顯增強，同時伴有神經(jīng)功能的改善[13-14]，提示CSPGs的表達增高是CNS損傷后神經(jīng)再生和功能突觸形成的不利因素之一；結(jié)合本研究一側(cè)大腦皮層梗死后梗死灶周圍皮質(zhì)及遠隔丘腦CSPGs及NG2、Neurocan表達增高，并與神經(jīng)功能缺失存在時間上的一致性，提示CSPGs可能參與了腦梗死后梗死灶局部及遠隔丘腦的神經(jīng)可塑性。

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The expression of chondroitin sulfate proteoglycans after focal cerebral infarction in hypertensive rats.

CHEN Xinran,YE Lanxiang,LIAO Songjie,GONG Qiong,YU Jian.
Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China.Tel:020-87332200.

ObjectiveTo examine the expression of inhibitory chondroitin sulfate proteoglycans(CSPGs)and investigate their potential effects on neural plasticity in the peri-infarct cortex and ipsilateral thalamus after focal cerebral infarction in hypertensive rats.MethodsTwenty-four adult renovascular hypertensive Sprague-Dawley rats per group were subjected to permanent rightmiddle cerebralartery occlusion(MCAO)or sham operation.Twelve ratswhich were selected randomly from per group at each time pointwere decapitated and their brainswere removed and cut into coronal sections at7 and 14 days postMCAO.The expression of CSPGs,NG2 and Neurocan was examined using immunostaining and western blot.ResultsAll rats displayed neurological deficits to varying degrees and the expression of CSPGs,NG2 and full length Neurocan was increased in the peri-infarct cortex and ipsilateral thalamus at 7 and 14 days(P＜0.05). However,there were no significant difference in either expression of CSPGs,NG2 and full-length Neurocan between 7 and 14 days or the expression of C-terminal fragment Neurocan at 7 and 14 days(allP＞0.05).ConclusionsCSPGsmay play a negative role in neural plasticity through induction of inhibitory environment in the peri-infarct cortex and ipsilateral thalamus follo wing focal cerebral infarction in hypertensive rats.

CSPGs Cerebral infarction Thalamus Neural plasticity

R743.3

A

2013-10-26）

（責(zé)任編輯：李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.04.004

☆國家自然科學(xué)基金（編號：81371276）；國家自然科學(xué)基金青年項目（編號：81100871）；中山大學(xué)培育青年教師基金（編號：09ykpy48）

*中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣州 510080）