王慶靈，劉文鑫，趙嘉平

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)開(kāi)放試驗(yàn)室，北京 100091；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，廣西憑祥 532600；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北保定 071001）

山海關(guān)楊PdERF-18轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)特征分析

王慶靈1，2，劉文鑫3，趙嘉平1

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)開(kāi)放試驗(yàn)室，北京 100091；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，廣西憑祥 532600；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北保定 071001）

對(duì)一個(gè)潰瘍病菌Botryosphaeriadothidea脅迫相關(guān)的山海關(guān)楊Populusdeltoides‘Shanghaiguan'乙烯反應(yīng)因子（ethylene responsive factors，ERFs）基因——PdERF-18基因的系統(tǒng)發(fā)育、編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)以及多種脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：PdERF-18基因編碼產(chǎn)物屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子家族B-6類(lèi)群，具有植物ERF轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)，但它與轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能密切相關(guān)的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域第19位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生替換，推測(cè)PdERF-18基因可能具有不同于其他典型ERF轉(zhuǎn)錄因子的功能；實(shí)時(shí)定量分析表明：潰瘍病菌、根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens（Rhizobiumradiobacter），脫水、機(jī)械脅迫、鹽脅迫和高溫處理、茉莉酸以及水楊酸處理均可誘導(dǎo)PdERF-18基因的上調(diào)表達(dá)。其中潰瘍病菌與茉莉酸處理以及根癌農(nóng)桿菌與水楊酸處理下，楊樹(shù)PdERF-18基因分別具有相似的表達(dá)特征，顯示潰瘍病菌、根癌農(nóng)桿菌侵染的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能分別與茉莉酸/乙烯途徑、水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。PdERF-18基因可以對(duì)多種非生物、生物脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，PdERF-18基因有可能作為一種新的遺傳資源而應(yīng)用于楊樹(shù)抗性遺傳改良。圖4參30

林木育種學(xué)；山海關(guān)楊；乙烯反應(yīng)因子；PdERF-18；水楊酸；茉莉酸；楊樹(shù)潰瘍病

AP2（APETALA2）/ERF（ethylene responsive factor，ERF）轉(zhuǎn)錄因子超家族是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)型，其共同的結(jié)構(gòu)特征是在DNA結(jié)合區(qū)包含1個(gè)或多個(gè)由約60～70個(gè)氨基酸組成的高度保守的AP2/ ERF結(jié)構(gòu)域。根據(jù)結(jié)構(gòu)域數(shù)目及其所結(jié)合的順式作用元件的差異，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族可分為：AP2，乙烯反應(yīng)因子，干旱反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（dehydration responsive element binding protein，DREB）和RAV 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。ERFs是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，研究證實(shí)ERF轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控包括植物生長(zhǎng)、發(fā)育在內(nèi)的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程［1-3］。另外，通過(guò)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域和PR基因啟動(dòng)子順式作用元件GCC-box（AGCCGCC）的結(jié)合，ERF基因參與植物對(duì)環(huán)境刺激，尤其是對(duì)病原菌脅迫的響應(yīng)。為了發(fā)現(xiàn)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在林木抗非生物脅迫以及抗病性中的作用，近年來(lái)，一些研究者對(duì)多年生木本模式植物——楊樹(shù)Populusspp.的ERF和DREB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了深入研究。Nanjo等［4］在脫水、高鹽、高溫、冷凍、脫落酸以及過(guò)氧化氫處理后的意大利楊Populusnigravar.italicaEST文庫(kù)鑒定到13個(gè)ERF/AP2轉(zhuǎn)錄因子，其中一些僅在特定的環(huán)境脅迫下特異表達(dá)。Zhuang等［5］對(duì)楊樹(shù)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族進(jìn)行了全基因組分析，鑒別出了91個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子以及77個(gè)DREB轉(zhuǎn)錄因子。Maki等［6］發(fā)現(xiàn)歐洲黑楊PopulusnigraERF基因——PncERF1基因在室溫生長(zhǎng)的楊樹(shù)細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)，僅對(duì)低溫處理后產(chǎn)生響應(yīng)表達(dá)。Li等［7］報(bào)道轉(zhuǎn)番茄SolanumlycopersicumERF轉(zhuǎn)錄因子的雜交楊Populusalba×Populusberolinensis獲得了對(duì)鹽脅迫的抗性，并且在200.0mmol·L-1氯化鈉下，轉(zhuǎn)基因楊的干物質(zhì)總量、樹(shù)高，葉片中脯氨酸含量、鈉離子（Na+）含量均高于非轉(zhuǎn)基因楊。最近，應(yīng)用數(shù)字基因表達(dá)方法（digital gene expression，DGE），Chen等［8］發(fā)現(xiàn)了2個(gè)鹽脅迫后下調(diào)表達(dá)的小黑楊Populussimonii×PopulusnigraAP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子。此外，研究發(fā)現(xiàn)ERF轉(zhuǎn)錄因子也在楊樹(shù)頂芽的休眠誘導(dǎo)和維持過(guò)程中表達(dá)［9］。近來(lái)，作者在潰瘍病菌脅迫的多種楊樹(shù)雜交無(wú)性系中發(fā)現(xiàn)1個(gè)特定ERF轉(zhuǎn)錄因子基因（ERF-18基因）的上調(diào)表達(dá)，預(yù)期該基因可能與楊樹(shù)的抗逆反應(yīng)相關(guān)。為深入揭示該基因的功能，本研究對(duì)中國(guó)優(yōu)良楊樹(shù)鄉(xiāng)土樹(shù)種——山海關(guān)楊Populusdeltoides‘Shanghaiguan'ERF-18基因（PdERF-18基因）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，實(shí)時(shí)定量PCR（real-time qPCR）技術(shù)檢測(cè)其在不同環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式，以期闡明該基因的功能和抗逆反應(yīng)機(jī)制，并為楊樹(shù)抗逆遺傳育種提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

植物材料：1年生山海關(guān)楊P23植株（中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所）。楊樹(shù)潰瘍病菌：葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea菌株CZ060（保存于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所），馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（含馬鈴薯浸粉20.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，瓊脂15.0 g·L-1），25℃下避光培養(yǎng)7 d。細(xì)菌病原：根癌農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens（Rhizobiumradiobacter）菌株GV3103，Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基（含胰蛋白胨10.0 g·L-1，酵母提取物5.0 g·L-1，氯化鈉10.0 g·L-1），37℃下避光培養(yǎng)48 h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山海關(guān)楊PdERF-18基因的克隆從山海關(guān)楊枝干距地面20.0 cm起，以滅菌打孔器每隔15.0 cm在樹(shù)皮上打孔10個(gè)·枝條-1，深度至露出木質(zhì)部，直徑為4.0 mm。將培養(yǎng)7 d的潰瘍病菌接種至接種孔，接種部位以保鮮膜密封保濕，室溫培養(yǎng)1，2，3，6，12，48，72 h后，刮取樹(shù)皮（去除接種部位的樹(shù)皮，芽點(diǎn)），液氮保存?zhèn)溆谩Ｒ詿o(wú)菌PDA培養(yǎng)基接種楊樹(shù)作為對(duì)照。利用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法［10］提取潰瘍病菌侵染的山海關(guān)楊總核糖核酸（RNA），Promega公司DNase消化，ND-8000核酸定量?jī)x（NanoDrop公司，美國(guó)）檢測(cè)RNA樣品純度，瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA樣品完整性。取2.0 μg總RNA樣品，以PrimeScriptⅡ第1鏈cDNA合成試劑盒（Takara公司，中國(guó)大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以引物（forward引物5′-TTTATGTCGGCTGAGTTTGA-3′）和（reverse引物5′-GAG GGGTTTCTGTTGATGA-3′）在山海關(guān)楊P23植株中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系包含1.0μL cDNA，200.0μmol·L-1dNTPs，0.2μmol·L-1PCR引物，16.67 nkatTaq酶；擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性1min；94℃30 s，62℃30 s，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物以Promega公司T-easy載體克隆到大腸埃希菌EscherichiacoliTOP10菌株，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.2PdERF-18基因及其編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析測(cè)序結(jié)果與毛果楊ERF基因（http：//www.phytozome.net/poplar）進(jìn)行比對(duì)分析，獲得山海關(guān)楊ERF-18（PdERF-18）基因的編碼序列（CDS），通過(guò)MEGA v5.0分析軟件［11］翻譯為氨基酸序列，應(yīng)用在線(xiàn)分析平臺(tái)ExPASy（http：//web.expasy.org/compute_pi/）計(jì)算蛋白質(zhì)分子量和預(yù)測(cè)編碼蛋白等電點(diǎn)。

1.2.3PdERF-18轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育分析依據(jù)ERF轉(zhuǎn)錄因子ERF/AP2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，參照Sakuma等［12］的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的分類(lèi)方法，應(yīng)用MEGA軟件［11］對(duì)PdERF-18基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。參比序列為12個(gè)擬南芥ArabidopsisthalianaERF轉(zhuǎn)錄因子序列。這些序列分屬6個(gè)ERF類(lèi)群。多序列比對(duì)采用MUSCLE軟件［13］，系統(tǒng)發(fā)育分析方法為鄰位連接法（neighbor joining，NJ），Bootstrap 1 000次檢驗(yàn)進(jìn)化樹(shù)各分支的支持率。

1.2.4 不同環(huán)境條件下PdERF-18基因的表達(dá)分析①激素處理。分別以20.0μmol·L-1水楊酸溶液（salicylic acid，SA），10.0μmol·L-1茉莉酸溶液（jasmonic acid，JA）噴霧處理1年生山海關(guān)楊葉片，1，3，6，12 h后取葉片，液氮保存后備用。無(wú)菌水處理的植株作為對(duì)照。②非生物脅迫處理。1）脫水處理：山海關(guān)楊植株小心從培養(yǎng)容器中取出，水洗去掉泥土，吸干根部水分后置于定性濾紙上，25℃下放置1，2，3，6，12 h后取葉片。以無(wú)菌水噴灑并作保濕處理的植株作為對(duì)照。2）高溫處理：將山海關(guān)楊在42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1，2，3，6，12 h后取葉片備用。室溫培養(yǎng)的材料作為對(duì)照。3）鹽脅迫：以100.0mL濃度為2.3mol·L-1氯化鈉的水溶液澆注山海關(guān)楊根部，處理1，3，6，12 h后取葉片備用。4）葉片機(jī)械損傷：在山海關(guān)楊葉片上以直徑4.0 mm的打孔器打孔3個(gè)·處理-1，處理1，2，3，6，12，24，48 h后取葉片備用。③生物脅迫。1）楊樹(shù)潰瘍病菌侵染：接種方法同1.2.1。2）根癌農(nóng)桿菌侵染：從山海關(guān)楊枝干距地面20.0 cm起，隔15.0 cm刺傷楊樹(shù)樹(shù)皮（在5.0 mm的范圍內(nèi)刺傷5個(gè)點(diǎn)），共刺傷10個(gè)部位。以滅菌木簽蘸取培養(yǎng)72 h的根癌農(nóng)桿菌菌落，接種于針刺點(diǎn)，接種完成后以保鮮膜封閉保濕，室溫下培養(yǎng)1，2，3，6，12，48，72 h后，刮取樹(shù)皮（去除接種部位的樹(shù)皮），液氮保存?zhèn)溆谩Ｒ源虃唇臃N的材料作為對(duì)照。以上試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)材料、對(duì)照均為3株·處理-1。對(duì)以上處理進(jìn)行總RNA提取，RNA提取方法同2.1.2。④生物及非生物脅迫下，PdERF-18基因的表達(dá)分析，采用Takara公司TAKARA SYBR Premix ExTaq（DRR041）（Perfect Real Time）試劑盒（Takara公司，中國(guó)大連）進(jìn)行山海關(guān)楊ERF-18基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測(cè)。RT-qPCR在ABIPrism 7500 HT序列檢測(cè)系統(tǒng)上（AB公司，美國(guó)）上完成，兩步法擴(kuò)增。RT-qPCR檢測(cè)引物為5′-CTTCTGTTC TTGAACTTGAC-3′和5′-CAAAGGATCGGTCAT AA AAG-3′。反應(yīng)過(guò)程如下：50°C 2 min，95°C 10 min，95°C 15 s，60 °C 1min，共40個(gè)循環(huán)；通過(guò)擴(kuò)增曲線(xiàn)以及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。采用生物學(xué)重復(fù)2次·樣品-1，采用技術(shù)重復(fù)6個(gè)·反應(yīng)-1。相對(duì)基因表達(dá)量計(jì)算采用2-⊿⊿CT法［14］，以UBQ基因（forward引物5′-GTTGATTTTTGCTGGGAAGC-3′；reverse引物5′-GATCTTGGCCTTCACGTTGT-3′）作為內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 山海關(guān)楊PdERF-18基因CDS序列克隆及序列分析

通過(guò)RT-PCR方法，在潰瘍病菌侵染的山海關(guān)楊中克隆到1個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子基因（PdERF-18），測(cè)序結(jié)果顯示：該序列包含完整的CDS序列［美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）序列登錄號(hào)：JX275831］，大小為936 bp，編碼312個(gè)氨基酸殘基。對(duì)比CDS序列和DNA測(cè)序結(jié)果，顯示PdERF-18基因不編碼內(nèi)含子。

結(jié)構(gòu)域分析顯示，PdERF-18基因編碼蛋白N端第89～137個(gè)氨基酸殘基區(qū)域?yàn)镋RF轉(zhuǎn)錄因子所特有的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域。AP2/ERF結(jié)構(gòu)域中，與ERF轉(zhuǎn)錄因子分類(lèi)及功能密切相關(guān)的第14編碼、第19編碼位點(diǎn)分別為丙氨酸（Ala，A）和谷氨酸殘基（Glu，E）。另外，N端72～88位點(diǎn)包含有由堿性氨基酸殘基組成的ERF轉(zhuǎn)錄因子核定位信號(hào)KRRR。而在C端則存在由大量酸性氨基酸殘基組成的保守序列，這可能是ERF蛋白的轉(zhuǎn)錄激活域。該區(qū)域可能與脅迫條件下，下游基因表達(dá)的激活有關(guān)［12］。

ExPASy軟件分析表明PdERF-18基因編碼蛋白質(zhì)的分子量（MW）為34 463.2 u，蛋白質(zhì)表面具有較低電勢(shì)，其等電點(diǎn)（PI）為4.63。

在楊樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的Blast分析結(jié)果顯示：PdERF-18基因與毛果楊ERF轉(zhuǎn)錄因子基因（POPTR_0008s11900.1和POPTR_0010s13540.1）高度同源。PdERF-18和POPTR_0008s11900.1的遺傳距離最小，僅為0.013，在312個(gè)氨基酸位點(diǎn)中，僅有6個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了替換。POPTR_0008s11900.1基因同樣不包含內(nèi)含子。因此，我們推測(cè)PdERF-18是POPTR_0008s11900.1的直系同源基因。

以AP2/ERF結(jié)構(gòu)域完成的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，山海關(guān)楊PdERF-18，POPTR_0008s11900.1和POPTR_0010s13540.1均屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子B-6類(lèi)群（圖1）。

圖1 山海關(guān)楊PdERF-18基因編碼蛋白AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)發(fā)育分析Figure 1 Phylogenetic analysis of ERF transcriptal factor based on the amino acid sequences of AP2/ERF domain

2.2 激素處理下PdERF-18基因的表達(dá)特征

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：水楊酸和茉莉酸處理均能誘導(dǎo)山海關(guān)楊葉部PdERF-18基因表達(dá)上調(diào)（圖2）。水楊酸處理后1～3 h，PdERF-18基因表達(dá)水平不變；處理后6 h，PdERF-18基因表達(dá)水平為對(duì)照的2.60倍；而在處理后12 h，PdERF-18基因表達(dá)水平為對(duì)照的4.92倍（圖2A）。在茉莉酸處理中，PdERF-18基因表達(dá)在3 h時(shí)達(dá)到峰值，其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的5.48倍，隨后基因表達(dá)水平逐漸下降；處理后12 h，PdERF-18基因的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的12%（圖2B）。結(jié)果顯示：PdERF-18基因?qū)τ谒畻钏岷蛙岳蛩岬姆磻?yīng)模式并不完全相同。在處理后1～12 h，茉莉酸誘導(dǎo)PdERF-18基因迅速到達(dá)表達(dá)高峰，隨后表達(dá)下降，甚至出現(xiàn)抑制表達(dá)；而水楊酸誘導(dǎo)的基因表達(dá)水平則在不斷增加。

2.3 非生物脅迫下PdERF-18基因的表達(dá)特征

脫水、高溫、鹽脅迫甚至機(jī)械創(chuàng)傷均可誘導(dǎo)山海關(guān)楊葉部PdERF-18基因的特異性表達(dá)。如圖3所示，在這4種不同的環(huán)境脅迫下，處理初期（1～2 h）PdERF-18基因基因表達(dá)水平不變或略有下降；處理后3～6 h，各處理樣品中PdERF-18基因的表達(dá)均大幅度上升。如，脫水、鹽脅迫和機(jī)械創(chuàng)傷6 h后，PdERF-18基因表達(dá)均達(dá)到最高峰，其相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的15.90，9.18和8.72倍；而高溫處理3 h時(shí)PdERF-18基因表達(dá)達(dá)到最高峰，其表達(dá)水平為對(duì)照的8.91倍，高溫處理6 h時(shí)，PdERF-18基因表達(dá)水平為對(duì)照的3.04倍。非生物脅迫處理6 h后，脫水和高溫處理樣品中PdERF-18基因幾乎不表達(dá)（相對(duì)表達(dá)量小于對(duì)照樣品10%），鹽脅迫和機(jī)械創(chuàng)傷樣品中基因表達(dá)則和對(duì)照表達(dá)水平相近；對(duì)于機(jī)械創(chuàng)傷樣品，在處理后48 h，仍能檢測(cè)到一定的基因表達(dá)。

圖2 激素處理下山海關(guān)楊葉部PdERF-18基因的表達(dá)模式Figure 2 Epression patternsof PdERF-18 gene induced by two phytohormones in Populus deltoids leaves

圖3 非生物脅迫下山海關(guān)楊葉部PdERF-18基因的表達(dá)模式Figure 3 Expression patternsof PdERF-18 gene responsive to abiotic stresses in Populus deltoids leaves

2.4 真菌及細(xì)菌脅迫下PdERF-18基因的表達(dá)特征

研究結(jié)果表明：葡萄座腔菌和根癌農(nóng)桿菌處理均能誘導(dǎo)山海關(guān)楊PdERF-18基因的上調(diào)表達(dá)。在處理后1～48 h，葡萄座腔菌侵染樣品的PdERF-18基因表達(dá)水平呈現(xiàn)近似正態(tài)曲線(xiàn)分布，處理后6 h，基因表達(dá)達(dá)到頂峰，其表達(dá)水平為對(duì)照的5.12倍（圖4A）。在本研究1～48 h的7個(gè)檢測(cè)點(diǎn)，根癌農(nóng)桿菌侵染樣品中的PdERF-18基因表達(dá)水平均大于對(duì)照樣品；在3～48 h的時(shí)間范圍內(nèi)，PdERF-18基因表達(dá)水平增加1.50倍以上，最高達(dá)到對(duì)照的3.14倍（圖4B）。

3 結(jié)論與討論

3.1 PdERF-18轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征

AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，尤其是AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的第14和第19位氨基酸殘基對(duì)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的分類(lèi)以及功能具有決定性的影響。DREB轉(zhuǎn)錄因子的典型特征是AP2/ERF結(jié)構(gòu)域中第14位纈氨酸（V14）和第19位谷氨酸（E19）殘基的存在。這2個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基替換（纈氨酸替換為丙氨酸，或者谷氨酸替換為天冬氨酸）均顯著降低了突變型的DREB分子與DRE作用元件（TACCGACAT）的結(jié)合能力［12］，并最終影響下游基因的誘導(dǎo)表達(dá)。而植物ERF轉(zhuǎn)錄因子的典型特征則是第14位丙氨酸（A14）和第19位天冬氨酸（D19）的存在［12］。例如在全部176個(gè)毛果楊PopulustrichocaroaERF轉(zhuǎn)錄因子（植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)PlantTFDB v2.0，http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn）中，有173個(gè)ERF具有以上特征。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，PdERF-18基因、楊樹(shù)POPTR_0008s11900.1和POPTR_0010s13540.1基因編碼產(chǎn)物的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的第14位丙氨酸保守存在，第19位天冬氨酸則被酸性更強(qiáng)的谷氨酸（E19）所替換。顯而易見(jiàn)，這種替換會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電勢(shì)的變化，并可能會(huì)影響ERF分子與其順式作用因子的結(jié)合能力。因此，我們推測(cè)PdERF-18轉(zhuǎn)錄因子可能具有與其他典型ERF轉(zhuǎn)錄因子不同的特點(diǎn)；或者由于第19位氨基酸殘基的替換，PdERF-18轉(zhuǎn)錄因子具有結(jié)合其他順式作用因子的能力。

3.2 ERF基因表達(dá)檢測(cè)的最佳時(shí)間

植物主要通過(guò)誘導(dǎo)型基因的表達(dá)而對(duì)各種環(huán)境脅迫發(fā)生響應(yīng)，而等植物誘導(dǎo)型基因（如PR蛋白基因、NBS-LRR蛋白基因等）的表達(dá)則受到特定轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控［15］。鑒于ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病、抗逆反應(yīng)以及生理代謝中的重要作用，ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的分離與功能研究成為了植物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。McGrath等［16］提出了有效分離克隆ERF基因2步法策略：即首先鑒定出在病原誘導(dǎo)早期表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子基因，然后對(duì)候選的轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因、功能鑒定。考慮到脅迫處理后，ERF基因可能具有的動(dòng)態(tài)表達(dá)特征，處理樣品的采集時(shí)間對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子的初步篩選具有非常重要的影響。

圖4 真菌及細(xì)菌病原脅迫下山海關(guān)楊枝干部位PdERF-18基因的表達(dá)模式Figure 4 Expression patternsofPdERF-18 gene responsive to fungaland bacterialpathogen inoculation in the stem bark ofPopulusdeltoids

研究表明：尖鐮孢菌Fusariumoxysporum接種6 h的樣品適宜于擬南芥ERF基因的初篩［16］，而高溫、低溫、脫落酸、萘乙酸、吲哚乙酸和赤霉素處理后，毛白楊DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的最高表達(dá)出現(xiàn)在處理后6 h，干旱和鹽脅迫下最高表達(dá)出現(xiàn)在處理后5 h和24 h［17］。而本研究結(jié)果顯示：除根癌農(nóng)桿菌外，其他7種生物或非生物脅迫均能誘導(dǎo)PdERF-18基因在處理后6 h高量表達(dá)，并且其表達(dá)水平均為對(duì)照的2.00倍以上?；谝陨系慕Y(jié)果，我們認(rèn)為應(yīng)用兩步法分離克隆ERF基因時(shí)，脅迫處理后6 h是樣品采集的適宜時(shí)間。

3.3 不同生物脅迫下山海關(guān)楊PdERF-18基因表達(dá)模式的差異揭示了生物脅迫類(lèi)型與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的聯(lián)系

植物抗病反應(yīng)過(guò)程中，病菌侵染信號(hào)的傳遞主要通過(guò)水楊酸（SA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑和茉莉酸（JA）/乙烯（ET）途徑完成。在擬南芥Arabidopsisthaliana中，2個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與對(duì)不同類(lèi)型病原菌的反應(yīng)。SA途徑主要在活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌的“Gene-for-Gene”抗性和系統(tǒng)抗性中發(fā)揮相關(guān)作用［18］。JA/ET途徑主要參與寄主多基因控制的對(duì)腐生型真菌、土傳真菌、卵菌等的抗性反應(yīng)［19-21］。楊樹(shù)中，JA/ET途徑與機(jī)械損傷反應(yīng)、黑斑病菌Marssoninabrunneaf.sp.multigermtubi侵染有關(guān)，在誘導(dǎo)楊樹(shù)間接、直接防御能力的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［22-24］。

楊樹(shù)潰瘍病是由葡萄座腔菌引起的中國(guó)北方地區(qū)主要林木病害，其病原為典型的弱寄生性真菌，同時(shí)具有一定內(nèi)生性。那么，楊樹(shù)通過(guò)哪種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)葡萄座腔菌侵染產(chǎn)生抗性反應(yīng)呢？本研究中，病原菌接種以及激素處理后ERF基因的表達(dá)模式為我們了解楊樹(shù)病害發(fā)生過(guò)程中的激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了新的視角。如圖2B和圖4A所示：潰瘍病菌侵染和茉莉酸處理后，PdERF-18轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化趨勢(shì)具有一致性，即在處理后基因表達(dá)水平逐漸上升，處理后3 h或6 h表達(dá)量最高，隨后表達(dá)水平逐漸降低，甚至達(dá)到對(duì)照水平之下。據(jù)此，我們推測(cè)山海關(guān)楊對(duì)于潰瘍病菌侵染和茉莉酸具有較為相近的應(yīng)激反應(yīng)，而楊樹(shù)潰瘍病發(fā)生中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能與JA/ET途徑途徑有較大相關(guān)性。

根癌農(nóng)桿菌不僅是重要植物遺傳轉(zhuǎn)化載體，也是常見(jiàn)的土傳細(xì)菌性病原，可以引起包括楊樹(shù)、桃樹(shù)Prunuspresica等在內(nèi)的許多植物的根莖部腫瘤。研究證明：植物根癌病的發(fā)生是根癌農(nóng)桿菌攜帶的毒性基因與植物的抗性基因之間親和性互作的結(jié)果［25-28］。本研究結(jié)果顯示：水楊酸處理和根癌農(nóng)桿菌侵染后山海關(guān)楊PdERF-18基因的表達(dá)也表現(xiàn)出較為一致的變化趨勢(shì)。因此，水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)通路可能在楊樹(shù)根癌病的信號(hào)傳遞過(guò)程中起著重要作用。然而，由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原因，我們僅僅檢測(cè)了水楊酸處理后0～12 hPdERF-18基因的表達(dá)，12 h之后水楊酸是否保持持續(xù)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，還需要在今后的研究中進(jìn)行深入的分析。

另外，很多ERF轉(zhuǎn)錄因子是水楊酸、茉莉酸和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑交叉處的重要成分，居于植物基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)位置［29-30］。本研究結(jié)果顯示：PdERF-18基因的表達(dá)不僅與多種生物及非生物環(huán)境脅迫相關(guān)，也與水楊酸和茉莉酸激素信號(hào)相關(guān)，因此，我們推測(cè)PdERF-18也可能處于楊樹(shù)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)位置。通過(guò)該基因的表達(dá)，楊樹(shù)對(duì)機(jī)械損傷、低溫、脫水、鹽脅迫以及潰瘍病菌和根癌農(nóng)桿菌侵染產(chǎn)生響應(yīng)。對(duì)山海關(guān)楊PdERF-18基因表達(dá)及功能的研究，可以深化對(duì)楊樹(shù)抗逆境脅迫能力的認(rèn)識(shí)，并為楊樹(shù)抗逆遺傳轉(zhuǎn)化提供新的基因資源。

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Expression patterns for a PdERF-18 response to different stresses in Populus deltoides‘Shanhaiguan'

WANG Qingling1，2，LIUWenxin3，ZHAO Jiaping1
（1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Institute of New Forestry Technology，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China；2.Experimental Center of Tropical Forestry，Chinese Academy of Forestry，Pingxiang 532600，Guangxi，China；3.College of Forestry，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China）

Ethylene responsive factors（ERFs），one kind of APETALA2（AP2）/ERF transcriptional factor that responds to environmental stimuli，especially to pathogen attacks，play an important role in plant-pathogen interactions.Recently，we noticed that oneERF-18 gene involved in the pathogenesis processes of the poplar stem canker disease of some poplar hybrid clones.However，the expression patterns of this gene response to other environmental stimuli are unclear.In this study，the phylogenesis，structure，and expression patterns of onePopulusdeltoidesERF gene（PdERF-18）were reported.Treatments including salicylic acid and jasmonic acid（JA）induction，BotryosphaeriadothideaandAgrobacteriumtumefaciens（Rhizobiumradiobacter）inoculation，mechanical stress，high temperature，salt stress，and dehydration stresswere tested with real-time reverse transcription polymerase chain reaction（RT-qPCR）.Results revealed aPdERF-18 coding for a B-6member in the ERF family B.The 14th alanine and 19th aspartate residues in the AP2/ERF domain，typically characteris-tic of plant ERFs，were altered with an aspartate site substituted by a glutamate（an amino acid residue with stronger electronegativity than aspartate）in the coding product for thePdERF-18 gene implying thatPdERF-18 mighthave some additional functions besides its resistance to a pathogen.RT-qPCR data of the diverse stresses revealed up-regulated expressed patterns inP.deltoides.Also，similar expression pattern responses for bothB. dothideaand JA aswell as responses toA.tumefaciensand salicylic acid were found.Thus，itwas inferred that the JA/ethylene（ET）transduction pathway regulated gene expression in poplar canker pathogen attacks，but the SA pathway was involved in the responsiveness to poplar crown gall disease；therefore，itwas deduced thatPdERF-18 was amulti-functional transcriptional factor involved in many biotic and abiotic stresses.［Ch，4 fig. 30 ref.］

forest tree breeding；Populusdeltoides；ethylene responsive factors；PdERF-18；salicylic acid；jasmonic acid；poplar canker disease

S722.3

A

2095-0756（2014）05-0716-08

2013-11-07；

2014-04-17

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（CAFINT2013C15）；國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)（2009FY210100）

王慶靈，從事林木病理學(xué)研究。E-mail：wql20062007@qq.com。通信作者：趙嘉平，副研究員，博士，從事分子植物病理學(xué)和植物逆境生理學(xué)等研究。E-mail：zhaojiaping@caf.ac.cn