李兵娟，肖國輝，許在恩，郭小勤

（浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安 311300）

新開發(fā)的禾本科通用性分子標記的檢測與評估

李兵娟，肖國輝，許在恩，郭小勤

（浙江農(nóng)林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江臨安 311300）

為開發(fā)更多的適用于禾本科Poaceae植物通用性分子標記，豐富竹類植物的遺傳信息，依據(jù)禾本科單拷貝同源基因（COSⅡ）已知序列的保守區(qū)域設計了14對引物，以此引物對剛竹屬Phyllostachys植物進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，并對部分擴增產(chǎn)物進行測序。結(jié)果所有引物可以在至少1個材料中得到特異性擴增，其中7對引物在5個供試材料中均能擴增到產(chǎn)物，13對引物在5個樣本中表現(xiàn)出多態(tài)性，占引物總數(shù)的92.9%。對部分擴增產(chǎn)物進行測序，所測序列均為特異性擴增序列。同一引物在不同樣本中的擴增片段間存在單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點，部分SNP位點會導致氨基酸序列提前終止或酶切位點變化。對有合適內(nèi)切酶存在的變異位點進行PCR-RFLP驗證，驗證結(jié)果與測序結(jié)果一致。利用NTsys 2.10e軟件，對5個供試竹種材料進行了親緣關系分析，毛竹Phyllostachys edulis與綠粉竹Phyllostachys virdiglaucescens親緣關系最近,紫竹Phyllostachys nigra與其他4個竹種親緣關系最遠。所開發(fā)的14個COSⅡ引物在剛竹屬植物中具一定通用性，同時挖掘出更多竹類植物中的遺傳信息。圖4表4參22

植物學；竹類植物；通用性分子標記；單拷貝同源基因（COSⅡ）；單核苷酸多態(tài)（SNP）；PCR-RFLP

竹類植物屬單子葉禾本科Poaceae植物，具重要的經(jīng)濟價值。全世界木本竹類有70多屬1 200余種［1］。中國是竹類資源最豐富的國家，素有“竹子王國”之稱［2］。雖然已對毛竹Phyllostachys edulis基因組進行了測序［3］，但關于竹類植物的研究仍集中在分子標記的開發(fā)與應用，功能基因的分離與生物學功能鑒定及高通量的轉(zhuǎn)錄組測序等［4-8］。目前，竹類植物中所開發(fā)的分子標記基本以未知序列為主，如隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD），限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism,RFLP），擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）等［4］，因此，開發(fā)出功能基因的分子標記用于比較基因組學及竹類植物中功能基因的挖掘日益重要。在許多植物類群的研究中，低拷貝的核內(nèi)基因相比能提供更多的信息位點，具備更強的優(yōu)勢［9-12］。Wu等［13］首次基于茄科Solanaceae植物開發(fā)出單拷貝直系同源基因（single-copy orthologous genes，COSⅡ）分子標記，并成功用于茄科植物間的同線性研究［14-15］。該標記是基于核基因內(nèi)保守的直系同源基因開發(fā)出來的一種新型分子標記，操作簡單、費用低。一般來說，COS標記位點都位于編碼區(qū)，通常涉及的基因是編碼生命必需的酶、輔酶或關鍵性調(diào)控蛋白的基因，具有很高的保守性。COS標記的開發(fā)對于比較作圖，線性同向序列分析，系統(tǒng)發(fā)生學和分子進化等方面的研究具有重要意義［16］。禾本科是種子植物中最有經(jīng)濟價值的。該科中水稻Oryza sativa，高粱Sorghum bicolor和玉米Zeamays等的基因組序列相繼公布，基于這些基因組序列，Liu等［17］共鑒定出2～684個COSⅡ基因，并開發(fā)出1 072個COSⅡ分子標記，該標記在竹類植物中具有較好的通用性。毛竹基因組序列雖已測序，但仍有部分基因未能獲得。因此，為開發(fā)更多的適用于禾本科植物通用性分子標記，豐富竹類植物的遺傳信息，我們采用同樣的方法開發(fā)了14對COSⅡ引物，在剛竹屬Phyllostachys植物中進行了檢測，對部分擴增結(jié)果進行了測序，并對其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點進行了分析和驗證。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

選取竹亞科Bambusoideae的5個竹種進行試驗（表1）。供試材料都采自浙江農(nóng)林大學翠竹園。竹葉采集時間為2012年4月，所采集的樣本均通過形態(tài)學鑒定，采集后用液氮速凍，放入-70℃冰箱保存。大腸埃希菌菌株Escherichia coli DH-5α和質(zhì)?；厥赵噭┖匈徸杂谏ど锕こ蹋ㄉ虾＃┯邢薰?。載體、聚合酶鏈式反應（PCR）試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。膠回收試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 葉片總RNA及基因組DNA提取采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取5個竹種葉片基因組DNA［18］。

1.2.2 COSⅡ引物設計參照Liu等［17］的方法，基于禾本科植物中COSⅡ基因序列設計了14對引物，引物序列及其在水稻中序列號如表2。

1.3 基因組DNA提取、PCR擴增

取各竹種葉片約2.0 g，采用改良CTAB法提取葉片總DNA。PCR反應體系總體積為10.0μL，其中含50 ng模板DNA；上游、下游引物各0.5μmol·L-1；200.0μmol·L-1三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTP）；1.0μmol·L-1Taq DNA聚合酶；1.0μL 10×PCR反應緩沖液（內(nèi)含氯化鎂）。采用降落PCR技術，反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s（遞減0.3℃·循環(huán)-1），72℃延伸1 min，10個循環(huán)；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，10個循環(huán)；72℃延伸5min。組合至少重復2次·引物-1，以確保擴增結(jié)果的可靠性。擴增產(chǎn)物在體積分數(shù)為6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上，穩(wěn)壓200 V，電泳80min。對膠染色，對聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離后的目的片段確認拍照。

表1 供試樣本材料Table 1 Samples used in the study

表2 引物序列Table2 Primer sequences of the 14 COSⅡmarkers

1.4 擴增結(jié)果的統(tǒng)計及遺傳進化關系的分析

以相同遷移位置記作1個擴增位點，記錄每對引物在5個材料中PCR擴增獲得的位點總數(shù)Nt；5個材料中擴增獲得的位點數(shù)Nb；及多態(tài)性位點數(shù)Np。在每個引物的相同遷移位點上，以“1”或“0”記錄條帶信息，其中“1”代表有擴增產(chǎn)物，“0”代表無擴增產(chǎn)物，建立一個數(shù)據(jù)矩陣。把距離矩陣輸入NTedit軟件中，用Ntsys模型構(gòu)建樹狀聚類圖。

1.5 序列測定、SNP檢測及RFLP驗證

將PAGE電泳后的目的條帶進行割膠回收，將其作為第2次PCR的模板，將2次PCR產(chǎn)物割膠回收再測序，對所得序列采用軟件DNAMAN進行比較，分析單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點。應用內(nèi)切酶SacⅠ分別對引物1在5個竹種的PCR產(chǎn)物回收進行酶切反應。反應體系及條件為PCR產(chǎn)物6.0μL，緩沖液1.0μL，內(nèi)切酶0.5μL，雙蒸水2.5μL，混勻，37℃水浴12 h，20.0 g·kg-1瓊脂糖電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增結(jié)果

利用新設計的14對引物分別對5個竹種進行PCR擴增。結(jié)果顯示：12對引物可以在至少3個材料中得到特異性PCR產(chǎn)物，其中7對引物在5個供試材料中均能擴增到產(chǎn)物（表3）。在可擴增出產(chǎn)物的引物中，有13對引物（92.9%）在供試材料中表現(xiàn)出多態(tài)性，僅引物11在供試材料間沒有多態(tài)性位點。對引物1從雷竹、毛竹、黃稈烏哺雞竹、紫竹、綠粉竹中擴增的條帶進行測序，測序片段的長度除綠粉竹是347 bp，其余都是363 bp（圖1）。綠粉竹與其他竹種間序列大小間的差異主要是由于該基因內(nèi)含子長度不一造成的。而且毛竹中獲得的序列與http://202.127.18.221/bamboo/網(wǎng)站上的序列完全一致。將所測序列與水稻序列進行比對，發(fā)現(xiàn)所擴增的序列與水稻序列間的同源性均達到92.77%以上，且在外顯子部分高度保守，內(nèi)含子表現(xiàn)出較大的差異，表明它們均為水稻的同源目標基因（圖2）。對引物2從5個樣本中擴增出的條帶進行測序，所得片段長度均為132 bp（圖1），分析發(fā)現(xiàn)該段序列不包含內(nèi)含子。同樣，從毛竹中獲得的序列與美國生物技術信息中心（NCBI）網(wǎng)站上的序列完全一致。對所獲得的序列進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)獲得的4條序列與水稻中該基因序列間的差異非常小，彼此之間的同源性均達到97.24%。

若按所用14對COSⅡ引物所在基因編碼產(chǎn)物的功能進行分類，可將它們大致分為5類，分別為蛋白質(zhì)修飾、細胞成分組裝、代謝、生化過程及其他。從拷貝數(shù)來看，這些引物所在基因在水稻中均為單拷貝，但本研究的結(jié)果顯示，在所擴增的樣本中同樣表現(xiàn)出單拷貝的特性。有些引物在某些供試材料所擴增出的位點有些具多態(tài)性，有些位點不具有多態(tài)性。

表3 不同引物在5個供試樣本中的擴增結(jié)果Table 3 Resultsobtained by PCR with COSⅡprimers in samples tested

2.2 供試材料的聚類分析

利用14對COSⅡ標記引物在這些試驗材料中擴增共得到56個多態(tài)位點。根據(jù)帶型的不同，計算試驗材料間的遺傳距離。根據(jù)遺傳距離，利用NTsys 2.10e軟件，得到5個樣本的聚類圖（圖3），紫竹與其他4個竹種親緣關系最遠，毛竹與綠粉竹親緣關系最近。該結(jié)果與形態(tài)學分類結(jié)果吻合。

圖1 2對引物在5個竹種的擴增結(jié)果Figure 1 PCR products of primer 1 and primer 2 in the 5 bamboo species separated by 6%non-denaturing PAGE gel

2.3 擴增片段單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析

序列比對分析發(fā)現(xiàn)，所擴增的序列存在豐富的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點。引物1所獲序列的編碼區(qū)（259 bp）存在41個SNP位點，多態(tài)性頻率為1 SNP/6.3 bp，其中轉(zhuǎn)換型SNP占90%，顛換型SNP占10%（圖2）。對引物1所編碼的氨基酸序列比對分析，發(fā)現(xiàn)9處SNP引起氨基酸的變異，且第61堿基處的T/C轉(zhuǎn)換，導致雷竹氨基酸序列的提前終止；第151堿基處的T/C轉(zhuǎn)換，導致毛竹氨基酸序列的提前終止。有些SNP位點也會引起酶切位點的變異，如第96堿基處的T/C轉(zhuǎn)換導致毛竹SacⅠ（GAGCTC）酶切位點的消失（圖4）。引物2所獲序列（132 bp）共存在7個SNP位點，多態(tài)性頻率為1 SNP/19 bp，其中2個轉(zhuǎn)換型，5個顛換型，這7個SNP引起2個氨基酸位點的改變（表4）。

2.4 PCR-RFLP驗證

引物1的擴增產(chǎn)物間存在多個SNP位點，為了驗證SNP的可靠性，采用限制性內(nèi)切酶SacⅠ對引物1在5個竹種的PCR產(chǎn)物進行酶切檢測，結(jié)果顯示：從毛竹中獲得的片段不能被內(nèi)切酶SacⅠ切開，的確在該酶切位點發(fā)生了變異，其余竹種的擴增產(chǎn)物在該位點均能被切為2條帶，且2條帶大小之和與原來的條帶大小吻合，電泳檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致（圖4）。

圖2 引物1擴增產(chǎn)物的序列比對Figure 2 Multiple alignmentof the Oryzasativa gene（LOC_Os12g0527850）and thesequencesof the5 bamboo speciesbased on theprimer1

圖3 5個供試樣本的聚類圖Figure 3 A dendrogram of samples based on 14 COSⅡmarkers

表4 引物2所擴增片段單核甘酸變異Table 4 Variation of single nucleotides in the segment of primer 2

3 討論

COSⅡ標記位點是物種進化上相對保守的位點，可用于不同的基因組之間比較作圖，構(gòu)建種間線性遺傳圖譜和分析遺傳關系。本研究參照Liu等［17］的方法，依據(jù)禾本科植物中COSⅡ基因序列設計了14對引物。利用這14對引物分別對5個竹種進行PCR擴增，結(jié)果顯示：11對引物可以在至少3個材料中得到特異性PCR產(chǎn)物，其中7對引物在5個供試材料中均能擴增到產(chǎn)物。選取2對引物的擴增條帶進行測序，相同引物擴增出的序列均為水稻的同源目的序列。引物1在5個樣本中獲得的序列間存在明顯差異，除內(nèi)含子序列差異較大外，在外顯子區(qū)域也存在豐富的SNP變異位點。這些SNP位點或者引起氨基酸位點變異，或者引起酶切位點變異，甚至會導致氨基酸序列的提前終止，如擴增序列中第96堿基處的差異導致毛竹SacⅠ（GAGCTC）酶切位點；第61和151堿基處的T/C轉(zhuǎn)換，分別導致雷竹與毛竹氨基酸序列的提前終止。我們還對供試材料進行了聚類分析，結(jié)果與形態(tài)學聚類結(jié)果一致，表明開發(fā)的14對COSⅡ引物在在剛竹屬植物中具有一定的通用性。

圖4 用SacⅠ酶切檢測結(jié)果Figure 4 PCR productsof primer1 in the 5 bamboo samples was digested with restriction enzyme SacⅠ

SNP是可以鑒定種下等級的最為精確的分子標記，可用于對親緣關系較近的近緣種及不同基因型的品種進行遺傳多樣性分析。由于SNP存在于整個基因組中，在許多重要基因座或鄰近區(qū)，比其他類型分子標記更能提供更多的特殊性標記，可以更直接、快捷地用于分子育種［19］。SNP位點的可靠性一般用PCR-RFLP方法驗證，此方法對外形上易混淆種類的鑒定具有準確、快速、價廉和重現(xiàn)性好等的優(yōu)點。本研究所測的引物1和引物2的擴增產(chǎn)物存在豐富的SNP位點，這一結(jié)果與竹類植物基因間存在豐富的SNP位點相吻合［3,19］。Germano等［20］通過PCR-RFLP方法鑒定出3個云杉Picea近緣種間的多態(tài)性。張婷等［21］采用該方法鑒別了藥用植物束花石斛Dendrobium chrysanthum，流蘇石斛Dendrobium fimbriatum及其形態(tài)相似種；曹東偉等［22］用該技術分析了中國櫻桃Prunus pseudocerasus分子親緣地理學研究。本研究亦采用PCR-RFLP方法對引物1所擴增的產(chǎn)物進行了酶切驗證，并鑒定出了毛竹和綠粉竹2個相似種。由此，本研究所獲得的標記在竹類植物中通用，并有望開發(fā)成SNP標記而將不同竹種分開。

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Universal geneticmarkers for the Poaceae family

LIBingjuan,XIAO Guohui,XU Zaien,GUO Xiaoqin
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

To develop more universalmolecularmarkers for grasses,rich genetic information of bamboo plants and 14 pairs of primerswere designed according to the conserved regions of the single-copy orthologous（COSⅡ）genes of the Poaceae（grass）family.Then,polymerase chain reaction（PCR）was used to test five bamboo accessions.Also,Primer 1 and Primer 2 were used to sequence parts of the amplified products,and single nucleotide polymorphisms（SNP）sites were validated with the PCR-restriction fragment length polymorphism（RFLP）test.Based on different band styles amplified with the 14 primer pairs,genetic distance was calculated with NT sys 2.10e software and a cluster analysis of five species:Phyllostachys edulis,Ph.viridiglaucescens, Ph.nigra,Ph.violascens,andPh.vivaxf.aureocauliswere conducted.Results showed that all primers exhibited specific PCR products in at least one sample.Seven pairs of primers were able to amplify the products in tested sampleswith 13（92.9%）pairsofprimersexhibiting polymorphic PCR products in allsamples.Sequencing showed that Primer 1 and Primer 2 were homologous.These sequences were amplified with the same primer and existed at SNP sites.Some SNP sites led to early termination of the amino acid sequence,and some resulted in changes of restriction endonuclease sites.Results of the PCR-RFLP test corresponded with the sequencing.The cluster analysis indicated thatPh.edulisandPh.viridiglaucescenswere closely clustered,andPh.nigrawas the most isolated.Overall,this classification coincided with morphological classification;so,thesemolecular markers were suitable for application in genetic analyses and other related research withPhyllostachys.［Ch,4 fig.4 tab.22 ref.］

botany;Bambusoideae;transferabilitymolecularmarkers;single-copy orthologous genes;single nucleotide polymorphism（SNP）;PCR-RFLP

S718.46

A

2095-0756（2014）04-0508-07

2013-10-14；

2013-11-22

國家自然科學基金資助項目（30901155）；浙江省自然科學基金資助項目（Y307499）

李兵娟，從事植物分子生物學研究。E-mail：libingjuan313@163.com。通信作者：郭小勤，副教授，博士，從事植物生物技術研究。E-mail：xqguo@zafu.edu.cn