熊 杰，錢 蜀，謝永洪，楊黎忠

1．四川省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，四川成都610041

2．上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海200233

目前世界各國(guó)水體富營(yíng)養(yǎng)化狀況日益嚴(yán)重，赤潮和水華暴發(fā)的環(huán)境問(wèn)題屢見(jiàn)不鮮。富營(yíng)養(yǎng)化水體不僅散發(fā)各種惡臭氣體污染空氣，更為嚴(yán)重的是各類藍(lán)藻水華的暴發(fā)會(huì)釋放出一種性質(zhì)非常穩(wěn)定的肝毒素物質(zhì)——微囊藻毒素(MCs)。MCs是由藍(lán)藻中的微囊藻、顫藻、魚(yú)腥藻等所產(chǎn)生的一類多肽毒素［1］，由于結(jié)構(gòu)原因，其化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，它的存在不僅會(huì)導(dǎo)致水生生物死亡，同時(shí)它還可以被魚(yú)、蝦、螺等各種水產(chǎn)品吸收進(jìn)入食物鏈，對(duì)人體健康產(chǎn)生間接威脅。MCs對(duì)肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)人體器官有強(qiáng)烈的毒素作用，是目前已得到確認(rèn)的最強(qiáng)的肝臟腫瘤促進(jìn)物。在眾多的微囊藻毒素異構(gòu)體中，微囊藻毒素-LR(MC-LR)是目前已知毒性最強(qiáng)、危害最大的一種［2］。

一般情況下，MCs很少通過(guò)口鼻吸入或皮膚接觸進(jìn)入人體，一般情況下是隨著生物鏈被人體食入或通過(guò)飲用水直接喝進(jìn)，有研究表明，多地居民原發(fā)性肝癌的高發(fā)生率、肝臟損傷、大規(guī)模腸胃炎的發(fā)病等均與當(dāng)?shù)仫嬘盟馐躆Cs的污染有直接關(guān)系［1，3-5］。由此可見(jiàn)，環(huán)境水體中 MCs含量水平的高低顯得尤為重要。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定飲用水中有關(guān)MC-LR含量的標(biāo)準(zhǔn)為1.0 μg/L［6］，加拿大健康組織規(guī)定可接受的藻毒素的限值為 0.5 μg/L［7］，澳大利亞學(xué)者也建議將0.001 mg/L作為允許的MC-LR的上限值。中國(guó)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)和《飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)也規(guī)定了地表水中MC-LR含量限值為0.001 mg/L。

鑒于MC-LR的高毒性，各國(guó)都對(duì)其含量制訂了很低的標(biāo)準(zhǔn)限值，這就對(duì)水中 MC-LR的含量檢測(cè)的靈敏度提出了極高的要求。目前針對(duì)水中MC-LR的監(jiān)測(cè)，主要有生物分析法、化學(xué)分析法和生化分析法。就化學(xué)分析法來(lái)說(shuō)，主要包括了氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、薄層色譜法(TLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)等。其中運(yùn)用最為廣泛的是固相萃取-高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法［8-10］。該類方法主要采用手動(dòng)或自動(dòng)固相萃取的前處理方式對(duì)大量水樣(一般需數(shù)升水樣)進(jìn)行富集濃縮，然后進(jìn)行測(cè)試，此類方法相比其他方法來(lái)說(shuō)具有較高的靈敏度，通過(guò)大量水樣的富集后，檢出限一般能夠達(dá)到μg/L或ng/L級(jí)，能夠更好地滿足水中痕量MCs的檢測(cè)要求，但是由于此類方法都需要進(jìn)行大量水樣的固相萃取，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，需要大量的有機(jī)試劑參與前處理，同時(shí)由于萃取小柱生產(chǎn)工藝的緣故，同一樣品重復(fù)性較差，而且固相萃取小柱價(jià)格普遍昂貴，分析成本相對(duì)較高。

目前，采用直接進(jìn)樣的方式對(duì)MC-LR進(jìn)行分析的方法僅見(jiàn)茅海瓊等［11］人的研究報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)各項(xiàng)色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)分別進(jìn)行優(yōu)化，大大提高了檢測(cè)靈敏度。不需要進(jìn)行大量水樣的富集濃縮，只需直接進(jìn)樣數(shù)十微升即可使檢出限達(dá)到 0.04 μg/L，測(cè)定下限可達(dá) 0.1 μg/L，完全能滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)水環(huán)境中MC-LR的限值要求，檢測(cè)靈敏度略優(yōu)于同類方法。同時(shí)從前處理到完成一個(gè)環(huán)境樣品的分析只需十幾分鐘，大大縮短了測(cè)試時(shí)間，提高了環(huán)境監(jiān)測(cè)效率，更好地適應(yīng)了現(xiàn)在樣品監(jiān)測(cè)任務(wù)繁重的形勢(shì)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng):高效液相色譜儀(日本);帶ESI源API4000QTrap三重四極桿串聯(lián)液相質(zhì)譜儀(美國(guó));MiliQ去離子水發(fā)生器(美國(guó))，Kromasil100-5C18柱(2.1 mm ×150 mm，5 μm)(瑞典)。

1.2 試劑

乙腈(HPLC級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);微囊藻毒素-LR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度99.99%，Enzo Life Sciences公司，美國(guó));MC-LR標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確向裝有100 μgMC-LR的標(biāo)準(zhǔn)瓶?jī)?nèi)加入乙腈溶液5.0 mL，濃度為20.0 mg/mL;MC-LR標(biāo)準(zhǔn)使用液:臨用時(shí)用超純水稀釋成濃度分別為0.10～200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.3 樣品采集及前處理

用1 000 mL棕色玻璃瓶采集滿瓶水樣，不留頂空，采集后儲(chǔ)存在4℃暗處，當(dāng)天分析。地表水及飲用水源地等干凈水樣可直接進(jìn)樣，如果水樣較臟或有明顯顆粒物可過(guò)0.45 μm水相濾頭(材質(zhì)為聚醚砜PES)后再進(jìn)樣。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

選擇Kromasil100-5C18柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)為分析柱，乙腈和0.1%甲酸水溶液作流動(dòng)相，流速設(shè)置為0.7 mL/min，柱溫40.0℃。采用梯度洗脫，在上述條件下樣品保留時(shí)間為4.13 min。見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，使用ESI(+)源分析，最佳噴霧電壓為5 500 V，氣簾氣(Curtain GAS)為 2 900.74 Pa，霧化氣(GS1)為 5 801.48 Pa，輔助加熱氣(GS2)為6 526.66 Pa，噴針溫度(TEM)為550℃。

通過(guò)針泵進(jìn)樣方式，對(duì)多反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行后優(yōu)化可得，母離子為M/Z=995.6［M+H］，碎片離子選擇響應(yīng)相對(duì)較高的m/z=135.4和m/z=213.4，對(duì)應(yīng)的碰撞能量分別為105.0、87.0 eV，去簇電壓(DP)為148 V，入口電壓(EP)為10 V，碰撞池電壓(CXP)為 －1 V，離子掃描時(shí)間為100 ms。(以m/z=135.4為定量離子)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 濾頭選擇

選擇3種不同品牌的同內(nèi)徑大小(φ=0.45 μm)的同材質(zhì)(聚醚砜PES)濾頭進(jìn)行實(shí)際水樣、加標(biāo)水樣的比較，發(fā)現(xiàn)樣品測(cè)試結(jié)果和加標(biāo)回收率并無(wú)明顯差別，考慮經(jīng)濟(jì)性，選擇相對(duì)便宜的濾頭進(jìn)行處理。

2.1.2 流動(dòng)相的確定

反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇不易將其從色譜柱上洗脫，即使使用100%的甲醇進(jìn)行沖洗時(shí)，色譜峰都有嚴(yán)重拖尾，不能準(zhǔn)確定量，因此改用乙腈做有機(jī)流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)峰型對(duì)稱且尖銳。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在超純水流動(dòng)相中加入一定量甲酸，能極大地提高響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度，但由于酸性溶液對(duì)色譜柱、質(zhì)譜均有腐蝕性，通過(guò)反復(fù)衡量、比較后確定甲酸溶液濃度為0.1%。

2.1.3 流速確定

由于流動(dòng)相流速直接影響樣品霧化程度和效率，從而影響檢測(cè)靈敏度，因此必須對(duì)流動(dòng)相流速進(jìn)行優(yōu)化。分別對(duì)流速?gòu)?.3～1.0 mL/min進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)流速越大，色譜峰越窄，信號(hào)也隨之增強(qiáng)，但流速大于0.7 mL/min后，檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度有所下降，經(jīng)綜合考慮后選擇0.7 mL/min為最佳流速(圖1)。

圖1 流速優(yōu)化曲線

2.1.4 洗脫方式選擇

環(huán)境水樣中有各種復(fù)雜的不明成分，采用等比例乙腈和甲酸水溶液進(jìn)行等度洗脫，雖然分析時(shí)間較短，能夠很快得到分析結(jié)果，但是在實(shí)際水樣的分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，水樣加標(biāo)回收率很低，懷疑水樣中有某些成分產(chǎn)生基體效應(yīng)，影響了水中MC-LR的霧化效率，導(dǎo)致靈敏度下降，不能滿足分析要求，因此選取了梯度洗脫，采用大比例水相(80%)先沖洗出部分干擾物質(zhì)后再提高有機(jī)相比例沖洗出MC-LR。采用梯度洗脫后，實(shí)際水樣的加標(biāo)回收率得到極大改善，加標(biāo)回收率可維持在95% ～110%。

2.1.5 色譜柱的選擇

根據(jù)MC-LR的性質(zhì)選擇C18反相色譜柱為分離柱，實(shí)驗(yàn)比較了waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)，Thermo ODSHYPERSIL(100 mm × 2.1 mm，5 μm)，Kromasil100-5C18柱(150 mm × 2.1 mm，5 μm)3種C18柱。在流速為0.7 mL/min的情況下，填料為1.7 μm的色譜柱柱壓過(guò)大，色譜柱極易受損失縮短使用壽命，而降低流速后信號(hào)也隨之下降，故而選擇填料粒徑較大的5 μm柱。在同等條件下，色譜柱長(zhǎng)度更長(zhǎng)時(shí)，將有更大的空間使環(huán)境水樣中各種復(fù)雜成分充分分離流出，使得目標(biāo)化合物的測(cè)定不受干擾，因而選擇Kromasil100-5C18(150 mm ×2.1 mm，5 μm)柱作為分離柱。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

MC-LR的分子量為995.2，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

圖2 MC-LR化學(xué)結(jié)構(gòu)式

根據(jù)MC-LR的理化性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)，選擇ESI源作離子源，正模式分析。配制濃度為1 μg/mL的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用針泵直接連接質(zhì)譜樣品傳輸管，針泵流速設(shè)置為10 μL/min。首先進(jìn)行“Q1MS”全掃找出母離子(m/z=995.6)并優(yōu)化其去簇電壓(DP)、入口電壓(EP)，再在“product ion”模式下對(duì)母離子進(jìn)行轟擊，找出豐度最大的兩個(gè)碎片離子(m/z=135.4;m/z=213.4)分別作為定量和定性離子，最后在“MRM”模式下進(jìn)一步確定CE，從而完成多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置。見(jiàn)圖3。

圖3 母離子與碎片離子譜圖

然后，再將高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)機(jī)，在LC-MS模式下確定最佳的噴霧電壓(IS)、氣簾氣(Curtain GAS)、霧化氣(GS1)、輔助加熱氣(GS2)、噴針溫度(TEM)等質(zhì)譜參數(shù)以獲得最強(qiáng)響應(yīng)信號(hào)，使得靈敏度最佳。

從進(jìn)樣口進(jìn)入的液態(tài)樣品被霧化氣吹成霧滴后，噴嘴加上高壓使其帶電。這樣的帶電霧滴在去除溶劑后形成樣品離子。電子噴霧電壓和霧化氣(GS1)對(duì)樣品霧化有相當(dāng)重要的影響，噴霧電壓過(guò)低，霧化氣壓力過(guò)小，流速太慢則不能使液態(tài)樣品完全離子化，噴霧電壓過(guò)高、霧化氣壓力偏大流速太大也會(huì)造成樣品在離子源內(nèi)部過(guò)早裂解造成損失。因此，合適的噴霧電壓和適當(dāng)?shù)撵F化氣壓力直接決定霧化程度的優(yōu)劣，從而決定了檢測(cè)靈敏度。

首先分別對(duì)噴霧電壓和霧化氣進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)噴霧電壓在5 500 V，霧化氣在5 801.48 Pa時(shí)響應(yīng)信號(hào)最高。

其次，儀器內(nèi)部的另2路氣流——?dú)夂煔?、溶劑氣主要作用是幫助去除樣品上的溶劑，防止形成霧滴后的樣品和溶劑直接進(jìn)入質(zhì)譜。理論上在不影響靈敏度的情況下，氣簾氣的流速越大越好，但是如果氣簾氣過(guò)大，在吹走雜質(zhì)和溶劑氣的同時(shí)也會(huì)帶走已霧化的目標(biāo)化合物，使靈敏度降低，因此合適的氣簾氣壓力十分重要。輔助加熱氣一般在較大的樣品流速情況下使用，可幫助溶劑的快速去除。因此必須對(duì)兩者的壓力進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，氣簾氣在2 900.74 Pa、輔助加熱氣在6 526.66 Pa時(shí)MC-LR信號(hào)最強(qiáng)。

噴針溫度也是影響樣品霧化的另一重要因素，同時(shí)高溫也幫助了溶劑快速揮發(fā)，避免過(guò)多的溶劑氣進(jìn)入質(zhì)譜高真空。一般情況下，噴針溫度在300～700℃范圍變化，通過(guò)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)溫度在550℃時(shí)MC-LR信號(hào)最強(qiáng)。參數(shù)優(yōu)化曲線見(jiàn)圖4。

圖4 各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化曲線

在上述最佳色譜條件和質(zhì)譜條件下，分別測(cè)試空白樣品(超純水)、濃度為0.1 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品(溶劑為超純水)和實(shí)際樣品(地表水)，上述樣品均直接進(jìn)樣25 μL。得到3類樣品譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 各類樣品譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別使用濃度為0.10～200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列直接進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1 137.5x－24.463，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

2.4 精密度

使用濃度為0.10、10.00、200.0 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)樣品重復(fù)測(cè)試6次，根據(jù)峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，再計(jì)算6次測(cè)試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。發(fā)現(xiàn)低、中、高3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品均有很好的精密性，RSD分別為5.6%、2.3%、1.9%。

2.5 檢出限

檢出限計(jì)算公式:

式中:n為樣品的平行測(cè)定次數(shù);Sd為n次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差;t為自由度為(n－1)、置信度為99%時(shí)的t分布的單邊臨界值，當(dāng)n=7，α=0.01時(shí)，t為3.143。

分別于900 μL實(shí)際水樣中加入100 μL濃度為1.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品(加標(biāo)量為0.1 ng)，重復(fù)測(cè)試7次，將7次分析得到的峰面積帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度，再根據(jù)檢出限計(jì)算公式確定出檢出限為0.04 μg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》和《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中MC-LR的標(biāo)準(zhǔn)限值(1.0 μg/L)，能夠滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)要求。

2.6 實(shí)際樣品分析及準(zhǔn)確度

2.6.1 實(shí)際樣品分析

根據(jù)上述分析方法，分別采集部分岷江、沱江流域地表水?dāng)嗝?，并按照?guī)范［12］進(jìn)行樣品保存和運(yùn)輸。將樣品過(guò)0.45 μm濾膜后上機(jī)分析。通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)兩江流域所有地表水均未檢出MC-LR。

2.6.2 準(zhǔn)確度及回收率實(shí)驗(yàn)

因目前無(wú)MC-LR質(zhì)控樣品，故進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度。采用往地表水樣品中加入高、中、低3種目標(biāo)化合物的方法進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試，即向18個(gè)裝有900 μL實(shí)際水樣的棕色小瓶中分別加入濃度為 100.0、10.0、1.0 μg/L 的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL(每種濃度同時(shí)測(cè)試6個(gè)平行加標(biāo)樣)，加標(biāo)濃度依次為 10.0、1.0、0.1 μg/L，直接進(jìn)樣 25 μL 分析，3 種濃度的樣品加標(biāo)回收率可控制在96.6% ～106%之間，能夠滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)質(zhì)量控制的要求。

2.7 方法比較

直接進(jìn)樣分析與采用固相萃取等前處理方式相比，既避免了繁雜的SPE過(guò)程，也無(wú)需使用有機(jī)試劑，更為重要的是避免了目標(biāo)物質(zhì)在繁雜的前處理過(guò)程中損失，大大提高了樣品的加標(biāo)回收率，更加完整地保留了樣品的真實(shí)成分。同時(shí)也避免了不同的固相萃取小柱之間的差異性，能夠更好地實(shí)現(xiàn)樣品分析的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

采用直接進(jìn)樣-高效液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜分析地表水中微囊藻毒素LR的方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密性，樣品無(wú)須前處理，只需簡(jiǎn)單過(guò)濾去除大顆粒物即可上機(jī)分析，方法簡(jiǎn)單便捷，分析速度快，靈敏度高，在監(jiān)測(cè)任務(wù)日益繁重的形勢(shì)下能夠更好地滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)的需求。

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